Atlas de histología vegetal y animal

Las células eucariotas se caracterizan por el reparto ordenado y dirigido de moléculas entre sus diferentes compartimentos. En muchos casos este reparto está mediado por vesículas. Las vesículas son pequeños compartimentos delimitados por una membrana que viajan entre algunos orgánulos y entre algunos orgánulos y la membrana plasmática. Sirven para transportar moléculas solubles y moléculas de membrana, que viajan en su interior o formando parte de la propia membrana de la vesícula, respectivamente.

El transporte vesicular supone una gran ventaja puesto que se pueden seleccionar de manera específica qué moléculas deben transportarse y a qué compartimento diana deben dirigirse. Por ejemplo, las moléculas de fibronectina deben ir a la matrix extracelular, no a los lisosomas. Pero ademas, las moléculas que llegan en las vesículas son necesarias para establecer identidad del propio compartimento y por tanto para determinar las funciones que éste puede llevar a cabo. Por ejemplo, las enzimas hidrolíticas ácidas deben ir a los lisosomas, pero no a los endosomas tempranos, y las integrinas han de ir a las membrana plasmática pero no cualquier otra membrana interna. Si no existiera especificidad en el reparto no habría compartimentos diferentes.

Las vesículas se forman en el compartimento fuente y se cargan con aquellas moléculas que deben ser transportadas. Una vez liberadas en el citosol, las vesículas son dirigidas hacia el orgánulo o compartimento diana, al cual reconocen, y con el que finalmente se fusionan. Entonces, las moléculas transportadas formarán parte del orgánulo diana y serán las responsables de su función. Sin embargo, otras moléculas sólo estarán de paso en ese compartimento y serán empaquetadas de nuevo en otras vesículas para dirigirse a otro compartimento celular. Es lo que ocurre con algunas proteínas que viajan en vesículas desde el retículo endoplasmático, pasan por el aparato de Golgi, donde son empaquetadas en nuevas vesículas hacia otros compartimentos como la membrana plasmática o los endosomas. Algunas moléculas volverán desde el compatimento diana al compartimento fuente del que partieron en un transporte de reciclado. Hay que tener en cuenta que la mayoría de los compartimentos, orgánulos y membrana plasmática, funcionan tanto como compartimento fuente como compartimento diana al mismo tiempo. Es frecuente que cuando un compartimento envía vesículas a otro, suele recibirlas también de este último. Así, la mayoría del tráfico vesicular entre dos compartimentos es bidireccional.

Para formar una vesícula funcional se necesitan multitud de herramientas moleculares (Figura 1):

a) Moléculas para reconocer y atrapar a las moléculas que se han de transportar. Otras moléculas adicionales tienen como misión formar la vesícula a partir de las membranas del orgánulo fuente. Hay que tener en cuenta que el proceso de formación de una vesícula es tremendamente complejo puesto que su membrana tiene que formar un pliegue y separarse de la membrana del orgánulo fuente.

b) La vesícula debe conseguir proteínas para interactuar con elementos del citoesqueleto para transportar a las vesículas desde el orgánulo fuente hasta el diana.

c) Por último deben incorporar moleculas para permitir a la vesícula reconocer y fusionarse con el orgánulo diana apropiado.

1. Formación de vesículas

La formación de una vesícula en cualquier compartimento fuente es un proceso complejo (Figura 2). Participan numerosas moléculas: las que delimitan el sitio de formación de la vesícula e inician el proceso molecular, las que seleccionan a las moléculas que tienen que ser transportadas, las que participan en la formación y escisión de la propia vesícula, las que permiten posteriormente deshacerse de las proteínas de recubrimiento, etcétera.

La formación de una vesícula es un proceso ordenado de reclutamiento de moléculas. Este proceso depende del tipo de vesícula. Los mecanismos mejor conocidos son los de las denominadas vesículas recubiertas por clatrina, COPI y COPII (Figuras 2 y 3). En el caso de las vesículas recubiertas por clatrina, en levaduras se estima que más de 65 proteínas diferentes intervienen en el proceso formación, y en las células de mamíferos unas 50, todas ellas provenientes del citosol.

Nucleación

En las vesículas recubiertas se ha propuesto que la nucleación se puede iniciar de diferentes maneras. a) En las vesículas recubiertas por clatrina la nucleación se inicia mediante una concentración alta y localizada del fosfoinosítido PI(4,5)P2 en la membrana, el cual capta a las moléculas adaptadoras, que a su vez captará a las cargas y favorecerá la captura de la cubierta de clatrina. Se ha sugerido que también se pueden dar concentraciones de cargas en lugares concretos de la membrana que ayudarían a captar a las proteínas adaptadoras. b) En las vesículas COPII la nucleación se produce mediante el reclutamiento de proteínas GTPasas Sar a la membrana del orgánulo fuente. Aunque esto ocurre en lugares concretos de la membrana, no se sabe cómo se inicia el proceso, ni cómo se selecciona el lugar de la membrana donde tendrá lugar la adhesión de estas moléculas. Las proteínas Sar son pequeñas moléculas que se activan e inactivan mediante la hidrólisis del GTP. Cuando las moléculas Sar son activadas en la membrana del orgánulo fuente se encargan de reclutar a otras proteínas (denominadas genéricamente como sec), las cuales son las encargadas de seleccionar de manera específica a las proteínas que deberán incorporarse en la vesícula para ser transportadas, y a las que formarán la cubierta (Figuras 2 y 3). En cualquier caso, podría parecer que el sitio de nucleación de una vesícula es aleatorio, pero hay muchos ejemplos en los que no es así. Hay regiones que favorecen esta nucleación, como las zonas de transición del retículo endoplasmático.

Cargas

En una vesícula se puede viajar de tres maneras: como proteína transmembrana, como ligando unido a un receptor y como molécula disuelta en el contenido de la vesícula. La importancia, tanto cualitativa como cuantitativa, de cada uno de ellos no está todavía clara. Las proteínas adaptadoras son capaces de reconocer secuencias señal en los dominios citosólicos de las proteínas transmembrana que a su vez reconocerán a las proteínas del interior del orgánulo fuente que deben ser transportadas. Por ejemplo, en las vesículas de exocitosis constitutiva deben viajar proteínas hacia la matriz extracelular, así como receptores transmembrana que deben quedar en la membrana plasmática. Las vesículas de clatrina transportan muy diversas cargas desde la membrana plasmática. Existen muchas proteínas en la cubierta de las vesículas que reconocen a las cargas.

Hay otras maneras de seleccionar moléculas para incorporarlas en una vesícula. Una es por la longitud de los dominios transmembrana de la proteína, es decir, la longitud de las cadenas de ácidos grasos de los lípidos que forman la membrana de la vesícula seleccionarán a proteínas que tengan dominios transmembrana, Secuencias de aminoácidos hidrófobos, de similar longitud. Proteínas con dominios transmembrana más cortos serán excluidas. Esto se ha demostrado en la formación de las vesículas recubiertas COPI en el retículo. Otro mecanismo de selección que también tiene en cuenta la longitud de los dominios transmembrana de las proteínas ocurre en las vesículas recubiertas con COPI, donde existen receptores como el Erv14 que son capaces de reconocer longitud de dominios transmembrana de proteínas que serán incorporadas a la vesícula. En este caso los receptores Erv14 son reconocidos por las proteínas adapatadoras Sec24. En levaduras los receptores Erv14 parecen captar hasta 1/3 de las proteínas totales de la vesícula. Las proteínas transmembrana que se encuentran en retículo y dominio cis del aparato de Golgi son más cortas que las que del dominio trans-Golgi/membrana plasmática/endosomas. Es decir, que las proteínas se sintetizan sabiendo a dónde deben ir.

Plegamiento

El conjunto inicial de proteínas (GTPasas, adaptoras, cargas, etcétera) se asocian formando agregados en la membrana. Cuando se alcanza una concentración crítica se dispara el reclutamiento de otras proteínas que terminarán de formar la cubierta de la vesícula. A este momento se le llama punto de transición, y una vez alcanzado la vesícula se formará. Si no se pasa el punto de transición las moléculas que forman los agregados iniciales pueden volver a segragarse en la membrana. Aparentemente, el número de cargas que ha conseguido reunir la vesícula es importante para que termine de formarse la vesícula. Si no es suficiente la vesícula no ser formará. Entre las proteínas de la cubierta externa están aquellas que permiten entrelazar todo el entramado proteico existente, curvar la membrana y dar volumen a la vesícula incipiente, servir de centros de nucleación de actina o permitir desnudar a la vesícula de estas cubiertas tras la escisión. Cuando las proteínas de la cubierta externa superan una cantidad (para la clatrina podría ser superior al 60 % del total que formará la vesícula) es cuando la curvatura de la membrana empieza a ser visible.

Escisión

La escisión es la separación de la vesícula de la membrana madre. Curvar la membrana de una vesícula y escindirla del compartimento fuente es un proceso coordinado que requiere energía y la participación de varias proteínas. Por ejemplo, hay proteínas que ayudan a las proteínas de la cubierta externa y que se insertan en una monocapa de la membrana gracias a unas secuencias de aminoácidos denominadas BAR que son capaces de generar curvatura en diferentes momentos de la formación de la vesícula. Por ejemplo, la proteínas GTPasa Sar1 participa en la fase inicial de la curvatura. La polimerización de filamentos de actina y la acción de la miosina son también necesarios para generar fuerzas motoras que ayudan en la protusión y posteriormente en la esción de las vesículas recubiertas por clatrina. La escisión o la independencia física de la vesícula respecto al compartimento fuente requiere de curvatura, fuerza motora, pero también de otras proteínas, denominadas dinaminas, que estrangulan la comunicación membranosa entre el compartimento fuente y la vesícula. Aquí, sin embargo, hay diferencias enter las vesículas recubiertas por clatrina y las recubiertas por COPII. Las vesículas recubiertas por COPII no precisan ni de dinamina ni de filamentos de actina para su formación. Tras la escisión muchas de las proteínas que envuelven a la vesícula son liberadas y devueltas al citosol para realizar un nuevo ciclo con la formación de una nueva vesícula, de manera que tenemos una vesícula casi desnuda.

Cargas especiales

Hay algunas cargas, como las moléculas de colágeno o los quilomicrones, que tienen que transportarse en vesículas muy grandes desde el retículo endoplasmático al aparato de Golgi. El tamaño molecular de estas moléculas excede a las pequeñas vesículas que se pueden formar con las cubiertas COPII (60-90 nm de diámetro). Y sin embargo, su transporte está mediado por COPII. Parece que la regulación de las moléculas GTPasas Sar1 es necesaria para la formación de estas vesículas. Por ejemplo, la mutación de Sar1B (uno de los genes para Sar) provoca la retención en el retículo de quilomicrones en el intestino e hígado. Otras moléculas también son necesarias para la formación de estas grandes vesículas. Una de ellas es TANGO1 ("transport and Golgi Organization), necesaria para el transporte de colágeno. TANGO tiene dos isoformas: TANGO1S y TANGO1L. TANGO1S interacciona con Sar1 y TANGO1L con la molécula de colágeno y con Sec23. El efecto neto de las dos isoformas es regular la actividad de Sar1 y enlentecer el reclutamiento de las proteínas de cubierta Sec13 y Sec31, por lo que a la vesícula le da tiempo a crecer antes de que se cierre la cubierta.

2. Viaje

Tras la separación del compartimento fuente se produce la eliminación de la cubierta. Hay dos mecanismos que favorecen la eliminación de las proteínas de la cubierta de la clatrina. Una la acción de chaperonas, como la HSC70, la otra es la defosforilación de PI(4,5)P2. La HSC70 se incorpora en la fase de escición de la vesícula y tras sustituir ADP por ATP provoca más tarde la desorganización y liberación de la cubierta. PI(4,5)P2 se convierte en PI4P, lo cual facilita la liberación de la cubierta. Como se puede ver PI(4,5)P2 es importante tanto en el proceso de ensamblaje como en el desensamblaje de la cubierta. La liberación de la cubierta de las vesículas permite que éstas puedan interactuar con el citoesqueleto y el compartimento diana.

Tras la separación del compartimento fuente, y la liberación de la cubierta, la vesícula es dirigida hacia el compartimento diana. Este viaje está mediado por proteínas motoras y elementos del citoesqueleto, tanto filamentos de actina como microtúbulos. En las células animales los microtúbulos juegan un papel importante en el tráfico de las vesículas, aunque también participan los filamentos de actina. Por jemplo, se han descubierto que los filamentos de actina forman uno haces, denominados cables de actina, que tienen uno de sus extremos en las proximidades de los lugares de endocitosis y el otro orientado hacia el interior de la célula, y que parecen ser importantes para el trasiego de vesículas de endocitosis. Sin embargo, en las plantas el tráfico vesicular está fundamentalmente mediado por los filamentos de actina.

3. Fusión de vesículas

El mecanismo de fusión de una vesícula con su compartimento diana es complejo (Figura 4). Ha de ser selectivo puesto que la célula ha de asegurarse de que una vesícula sólo se fusiona con aquel compartimento para el que las moléculas que transporta han sido destinadas. Pero además, abrir y fusionar membranas supone saltar una barrera termodinámica importante. Esto se hace en pasos sucesivos.

Anclaje

El primer paso es un reconocimiento inicial o anclaje (en inglés: "tethering"). Esto requiere que haya una especie de etiqueta a modo de código postal en la vesícula que sea reconocida por el compartimento con el que se ha de fusionar. Este reconocimiento inicial es similar al de una caña de pescar anclada en el compartimento diana que reconoce y ancla ("pesca") una vesícula que tiene unas determinadas moléculas. Las "cañas" de pescar son unos complejos proteicos asociados a las membranas del compartimento diana. Hay distintos tipos complejos: Golginas, CORVET, Dsl1, exocysto, GARP/VFT, HOPS/Class C VPS, TRAPPI y TRAPPII, que se distribuyen de forma selectiva en distintos compartimentos (Figura 5). Estos complejos pueden cambiar entre estado estirado y contraído, pudiento en algunos casos medir más de 200 nm de longitud, lo que indica que es una caña molecular bastante larga. Por ejemplo, las proteínas de las membranas del Golgi que capturan vesículas se denominan golginas. Estas proteínas se extiende unos 100 a 600 nm desde las membranas de las cisternas Golgi. Hay 11 golginas. La presencia de estas moléculas es suficiente para capturar vesículas ("tethering") y su localización diferencial en los diferentes compartimentos del Golgi (cis, medio y trans) permite seleccionar qué vesículas se capturan en cada dominio. Por ejemplo, las que hay en el cis capturan vesículas que se han formado en el retículo endoplasmático y las que hay en el lado trans vesículas que vienen desde los endosomas. Aquellas golginas que están en los bordes de las cisternas intermedias capturan vesículas que se ha formado en el propio Golgi.

Las moléculas reconocidas por estas proteínas largas en la vesícula es muy variable. Puede ser desde moléculas concretas, lípidos o proteínas, hasta la organización molecular. Por ejemplo, las golgina GMAP-210 tiene un extremo distal que es capaz de reconocer vesículas por el tamaño, composición lipídica de la membrana y por el grado de empaquetamiento lipídico. Esto parece suficiente para reconocer a las vesículas que vienen del retículo. Otras golginas son capaces de reconocer proteínas presentes en las membranas de las propias vesículas.

Todas las vesículas transportan proteínas Rab-GTPasas (en humanos 60 tipos), que son de distinto tipo dependiendo del compartimento fuente, o parte del compartimento fuente, donde se haya formado la vesícula. Se pensaba que estas proteínas eran la principal etiqueta de la vesícula a la hora de ser reconocida por el compartimento diana. Sin embargo, parece que participan en una fase posterior. Por ejemplo, todas las golginas unen Rab-GTPasas en un lugar distinto al de anclaje. Esta diferencia de lugar hace pensar que las RabGTPasas no participan en el reconocimiento inicial sino en pasos posteriores, cuando la vesícula se tiene que acercar a la membrana del compartimento diana. Las proteínas RabGTPasas podrían forzar el plegamiento de las golginas y así acercar la vesícula a la membrana.

Atraque y fusión

El reconocimiento inicial descrito anteriormente es esencial para los pasos posteriores. Tras el anclaje y acción de las proteínas Rab-GTPasas, hay otras proteínas que favorecen el atraque de la vesícula a la membrana del compartimento diada. Se llaman proteínas MTC ("multi-subunit tethering complex"). Son una familia de proteínas con una distribución diferencial. Su misión es acercar aún más la membrana vesicular a la membrana del compartimento diana para que se pueda dar otro reconocimiento adicional entre otras proteínas denominadas SNARE. Son proteínas transmembrana (en humanos hay 37 diferentes) de las cuales hay dos tipos: v-SNARE y t-SNARE. Las v-SNARE se incorporan en la vesícula durante su formación en el compartimento fuente y las t-SNARE se encuentran en las membranas del compartimento diana. La interacción entre v-SNARE y t-SNARE provoca un acercamiento mucho mayor de las membranas de la vesícula y del compartimento diana, liberando además la energía necesaria para la fusión de ambas membranas. Sin embargo, para la fusión de la membrana vesicular y del compartimento fuente, otras proteínas parecen cooperar con las proteínas SNARE. La fusión de membranas es un proceso termodinámicamente desfavorecido. Las SNARE son otra capa de especificidad en el reconocimiento del compartimiento diana por una vesícula determinada. Por ejemplo, las parejas v-SNARE y t-SNARE de la comunicación entre retículo-golgi, Golgi-Golgi, endosomas-Golgi, son diferentes.

Los filamentos de actina parecen tener un papel relevante en la fusión de las vesículas, al menos durante la secreción regulada (Figura 6). En el caso de las neuronas, en el terminal sináptico, hay un recubrimiento de filamentos de actina bajo la membrana que impide que las vesículas entren en contacto con la membrana plasmática. Los filamentos de actina podrían funcionar como una barrera física para evitar la fusión prematura de las vesículas. Pero a la vez este entramado de actina, y su proteína motora miosina, parece también importante para la expulsión rápida del contenido vesicular una vez que se ha producido la fusión de membranas. La actina también parece implicada en la conducción de las vesículas hacia su lugar de liberación en algunas células. El proceso sería el siguiente: la actina cubre normalmente la superficie interna de la membrana plasmática, tras la llegada de la señal de exocitosis el entramado de actina disminuye en densidad y permite el contacto entre las membranas de la vesícula y la membrana plasmática, una vez producida la fusión se recluta de nuevo la actina que polimeriza alrededor de la vesícula cubriéndola por completo y comprimiría la vesícula para acelerar la liberación del contenido vesicular. Lo que parece atraer y favorecer la polimerización de la actina sobre la vesícula es la composición lipídica, sobre todo la presencia de el fosfoinosítido PIP2. PIP2 no está presente en la membrana de las vesículas pero sí tras el inicio de la fusión, donde llega por difusión lateral desde la membrana plasmática. Es en esta posición nueva podría favorecer el reclutamiento de proteínas que favorecen la polimerización de filamentos de actina.

Hay que tener en cuenta que la fusión entre membranas celulares no siempre involucra a una vesícula y a un compartimento diana. Se producen fusiones entre compartimentos semejantes como ocurre con los endosomas, las mitocondrias o incluso entre vesículas. Se cree que todos estos casos se siguen mecanismos parecidos con implicación de moléculas similares.

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