Atlas de histología vegetal y animal

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Técnicas histológicas

2. FIJACIÓN

Todos los tejidos, bien cuando se extraen de un organismo, o bien cuando muere el organismo en el que están, sufren dos tipos de procesos degradativos: autolisis por acción de enzimas intracelulares, es decir, autodigestión, y putrefacción por acción bacteriana. Además, el procesamiento histológico posterior del tejido para poner de manifiesto y observar determinadas estructuras supone una metodología que puede degradar o alterar las estructuras tisulares. Fijar un tejido es preservar sus características morfológicas y moleculares lo más parecidas posibles a las que poseía en su estado vivo. O dicho de otra manera, la fijación disminuyen los cambios en los tejidos desde que se obtienen hasta que se observan, tanto en organización estructural como en composición química. Es como hacer una fotografía del tejido vivo para poder observarla, tras algún tratamiento, con el microscopio. Una buena fijación es importante porque de ello depende una interpretación correcta la observación tisular. Puede ser la diferencia entre un buen y un mal diagnóstico de una patología, basado en diferencias en la organización del tejido o en las características de los núcleos de las células.

La fijación mata a las células y debe evitar la autolisis, proteger a los tejidos frente a ataques bacterianos, insolubilizar elementos solubles que se quieren estudiar, y evitar distorsiones y retracciones tisulares que afecten al volumen o a la morfología. Además, debe preparar al tejido para poder llevar a cabo técnicas específicas posteriores, si es necesario, y mantener las características del tejido en procesos histológicos como las inclusiones.

Hay fijadores físicos, que son calor o congelación, y químicos, que son aquellos que forman enlaces químicos con moléculas del tejido. Cada uno tiene sus ventajas e inconvenientes. Los más usados hoy en día para microscopía óptica y electrónica son los fijadores químicos.

El método ideal de fijación química es por perfusión. Para ello se introduce el fijador a través del sistema vascular, asegurando de esta manera que todas las células del órgano perfundido reciben el fijados casi instantáneamente y al mismo tiempo. Obviamente esto se puede hacer en animales de experimentación. Sin embargo, para biopsias o para plantas el método de fijación es la inmersión, es decir, sumergir la muestra en el fijador, el cual llegará a todas las partes de la muestra por difusión.

No existe un fijador universal, ni un método de fijación único. Incluso podemos usar varios fijadores secuencialmente según nuestras necesidades. La elección depende de las características fijadoras que necesitemos, tanto por el tipo de tejido como por la técnica posterior a la fijación que queramos aplicar. Por ejemplo, si queremos estudiar actividades enzimáticas debemos usar un fijador que no nos altere el centro activo de las enzimas en las que estamos interesados, y quizá para ello tengamos que sacrificar en cierta medida la morfología tisular. La mayoría de los fijadores no preservan los lípidos, los cuales permanecerán en el tejido mientras no usemos disolventes. Así, si queremos estudiar la ultraestructura celular debemos usar fijadores que fijen los lípidos y que por tanto protejan a las membranas celulares durante el procesamiento de inclusión en resinas, que conlleva el uso de solventes orgánicos. Asimismo, la mayoría de los fijadores no fijan los carbohidratos pero éstos permanecen en el tejido porque están unidos a las proteínas. Por otra parte, si queremos teñir un determinado componente celular con muy poca afinidad por los colorantes quizá debamos usar un fijador que lo modifique para que sea reconocido más fácilmente por los colorantes.

En cualquier caso hay características de los fijadores químicos que tenemos que tener en cuenta antes de su uso:

Velocidad de penetración. El proceso de fijación ha de ser rápido y la velocidad de difusión de la sustancia fijadora en los tejidos es un factor determinante. En la fijación por inmersión este parámetro condiciona el tamaño de la pieza que queramos fijar, más pequeña cuanto menor sea la velocidad de difusión del fijador empleado. También determina el tiempo de fijación, mayor cuanto menor tiempo de difusión.

Velocidad de fijación. Esta característica no dependen de la velocidad de difusión sino de las propiedades químicas del fijador y condiciona el tiempo que debe permanecer el tejido en contacto con el fijador. Téngase en cuenta que la fijación es una reacción química.

Endurecimiento. Los fijadores generalmente endurecen los tejidos, lo cual depende del tipo de fijador y del tiempo que el tejido haya estado expuesto a él.

Ósmosis y pH. Es indispensable evitar cambios de volumen en la células producidos por una osmolaridad del fijador diferente a la del tejido. Por tanto, en muchas ocasiones hay que equilibrar la osmolaridad de las soluciones fijadoras y la de los tejidos a fijar. No es necesario añadir sustancias complejas. Por ejemplo, para los tejidos de animales terrestres basta con añadir 0.9 % de cloruro sódico. Son sales que no afectan a la capacidad del fijador. Normalmente se suelen usar soluciones amortiguadoras que mantienen un pH semejante al del tejido e isoosmóticas con dicho tejido.

Temperatura. La fijación a temperaturas más altas que la temperatura ambiente suelen incrementar la velocidad de fijación del tejido, pero también acelerar la degradación del tejido que todavía no ha sido fijado.

Efecto mordiente. Algunas estructuras tisulares son difíciles de teñir puesto que tienen poca apetencia por los colorantes. Esta apetencia puede ser incrementada con un tratamiento previo. Algunos fijadores, además de fijar, modifican químicamente a ciertas estructuras celulares para que posteriormente puedan unirse a ellas los colorantes. Este este tipo de modificación química se le denomina efecto mordiente.

Artefactos. Una artefacto es cualquier alteración introducida en eltejido consecuencia del proceso histológico. La fijación podría decirse que es el paso que más influye en el procesamiento histológico. Al contrario que la tinción o una pobre inclusión en parafina, la fijación es irreversible. Los procesos de fijación, dependiendo del fijador o del método de fijación, pueden acarrear alteraciones tisulares tales como variaciones morfológicas, cristalización de compuestos, desplazamiento de sustancias, etcétera. Estos cambios pueden producirse por las características del fijador o por un mal uso de éste. En cualquier caso deben tenerse en cuenta para no describir como características tisulares lo que es una alteración introducida durante la fijación. Una consecuencia frecuente son las retracciones o encogimientos de la muestra, lo cual se puede comprobar midiendo la muestra antes y después de la fijación. No debe asumirse que las posibles alteraciones afecten a todos los tejidos o estructuras por igual.



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