Si una célula ha de dividirse o no, y cuántas veces, es algo que debe estar regulado en los organismos pluricelulares. Este control se aplica para alcanzar un tamaño corporal adecuado durante el desarrollo, qué es típico de la especie. Hay que pensar que las células de una ballena y de una sardina son muy similares en tamaño, pero la ballena tiene más células. También es importante en las diferentes partes del cuerpo. Por ejemplo, las células de un brazo deben dividirse un número de veces semejante a las células del otro brazo, puesto que de otra manera tendríamos brazos de diferente tamaño. Además, es crucial en aquellos tejidos que necesiten renovación celular donde mueren muchas células diariamente de forma natural como las de la epidermis o las de las sangre.
Cuando una célula está dividiéndose, en cada ciclo de división, pasa por cuatro etapas llamadas: G1, S, G2 y M (Figura 1). G es por "gap" o intervalo, S por síntesis y M por mitosis. Se pensaba que durante las fases G1 y G2 no ocurría nada relevante, por eso el nombre “gap”. Sin embargo, en estas dos fases la célula crece y se prepara para tener todo listo para la siguiente fase. Algunas células abandonan el ciclo celular en G1 para diferenciarse, permanecer inactivas (G0), en estado envejecido (“senescence”) o morir. Algunas de estas células, las que están en G0, pueden retornar a G1 y continuar otra vez con el ciclo celular. También lo pueden hacer algunas células diferenciadas como las células parenquimáticas de las plantas. En la fase S se produce la replicación del ADN y en la fase M ocurre la mitosis, que es la segregación de los cromosomas duplicados entre las células hijas, y la citocinesis, que es la división del citoplasma.
Puntos de control
En puntos estratégicos del ciclo celular hay momentos en que se establecen controles moleculares ("checkpoints"). Los controles moleculares son conjuntos de moléculas que permiten o no seguir con el ciclo celular según las condiciones en las que se encuentre la célula. Su misión es asegurarse de que se ha conseguido todo lo necesario para avanzar en el ciclo celular y que la siguiente fase se producirá con éxito. Si no es así, estos controles bloquearán el avance del ciclo celular.
Pasar un punto de control supone la activación de ciertas moléculas y, normalmente, la expresión de nuevos genes que codifican para proteínas necesarias en las siguientes fases. También es importante la inactivación o eliminación de otras proteínas, sobre todo por degradación mediante la acción de ubiquitinas-proteosomas (ver más abajo). Hay cerca de 100 genes que se expresan cíclicamente durante el ciclo celular y que tienen un papel en los distintos puntos de control. Entre los más importantes de éstos están los que codifican para proteínas denominadas ciclinas.
Localización
Hay varios puntos de control importantes en el ciclo celular (Figura 2).
G1/S. Al final de la fase G1, y antes de entrar en la fase S, hay un control muy restrictivo, tanto que se denomina punto de restricción ("restriction point"). Si la célula pasa este control el ciclo celular avanzará, independientemente de las señales externas, pero pasarlo necesita muchas tareas resueltas previamente y la ayuda de estímulos externos. Este punto es tan importante porque en la fase S se replicará el ADN, y tiene que hacerse con todas las garantías, y porque la célula tiene que ser instruida por el entorno para dividirse porque es necesario para el organismo. Las células cancerosas pasan a la fase S independientemente de las señales externas debido a mutaciones en las proteínas involucradas en este punto de control.
S. En la fase S hay un punto de control que vigila que la replicación del ADN se produzca correctamente: que sea completa y que se produzca sin fallos.
G2/M. Al final de la fase G2 hay otro punto de control que determina la entrada en la fase M. Se asegura de que la célula ha crecido los suficiente, que el genoma no está dañado y que está todo dispuesto para empezar la condensación y el reparto de los cromosomas y del citoplasma entre las células hijas.
M. En la transición entre metafase y anafase, durante la mitosis, hay otro punto de restricción para asegurarse de que todos los cromosomas están bien alineados en la placa de metafase. Así, que la segregación de las cromátidas entre las dos células hijas será correcta.
CDKs: quinasas dependientes de ciclinas
Una de los enzimas importantes que actúan en los puntos de control son las denominadas quinasas dependientes de ciclinas (CDK; "cyclin dependent kinases"). Estas enzimas, cuando están activas, ayudan a pasar los puntos de control mediante la fosforilación de moléculas muy variadas. Hay en la célula unas 20 CDKs diferentes, pero las relacionadas con el ciclo celular son la 1, 2, 4 y 6. CDK4 y CDK6 son promotoras de G1, CDK2 actúa al final de G1 y en la fase S, y CDK1 permite la entrada en mitosis y el paso de metafase a anafase. Hay otras CDKs, como la CDK7, que es capaz de activar a estas CDKs, y la CDK3, que permite salir a la célula de la inactividad (G0) y entrar de nuevo en G1 para reiniciar el ciclo celular. Cada una de ellas se activa en determinadas fases del ciclo celular y algunas dependen del tipo de tejido. La actividad de las CDKs está muy regulada, es decir, necesitan que una serie de condiciones se cumplan para activarse (Figura 3). Como su nombre indica, necesitan asociarse a una proteína denominada ciclina para ser activas. Otras quinasas y fosfatasas añaden y eliminan grupos fosfatos a las CDKs, respectivamente, los cuales pueden ser activadores o inhibidores de su actividad. Por último, hay otras proteínas inhibidoras que, si están presentes, se unen a las CDKs y las inactivan, incluso si todo lo demás requisitos necesarios para su actividad se han cumplido adecuadamente.
Parece que la diversidad de CDKs que hay en la célula no es esencial para la proliferación, y esto puede ser porque hay una alta redundancia en sus funciones, es decir, unas CDKs podrían suplir la actividad de otras. Por ejemplo, la CDK1 es capaz de suplir la carencia de todas las demás CDKs en embriones tempranos de ratón. En levaduras una sola CDK puede llevar a cabo el ciclo celular sin problema cuando se anulan las demás. Sin embargo, la variedad de CDKs existentes en las células normales puede aportar versatilidad en el comportamiento y respuesta a estímulos externos variados.
Ciclinas
La ciclinas son proteínas que se sintetizan y se degradan periódicamente en distintas etapas del ciclo celular (Figura 4), y son necesarias para el funcionamiento de las CDKs. La primera ciclina, la ciclina D, se descubrió en 1990. Se han encontrado hasta 16 ciclinas diferentes en las células eucariotas, siendo las más importantes para el avance del ciclo celular las A, B, D y E. Las ciclinas D (hay 3) y E (hay 2) son importantes para el avance de la fase G1, la A y la B para el avance de la fase G2 y realización de la mitosis. Cada ciclina se expresa en un momento determinado del ciclo celular y e interactúa con CDKs específicas: CDK1 interactúa con la ciclina A y B; CDK2 con las ciclinas A, B y E; CDK 4 y 6 con la ciclina D.
Degradación. Ubiquitinas. APC/C
La degradación de la ciclinas en momentos clave del ciclo celular es tan importante como su síntesis para que el ciclo celular avance adecuadamente. La ubiquitina es una molécula conservada y presente en todas las células eucariotas que se enlaza covalentemente a otras proteínas. La unión de muchas ubiquitinas marca a esa proteína para su degradación o para modificar su función. La degradación de las ciclinas está mediada por varios complejos, como el complejo APC/C (“anaphase promoting complex/cyclase”), que promueven la ubiquitinizaicón de las ciclinas en momentos concretos del ciclo celular y las marcan para su degradación.
Factores internos y externos
Que una célula se vaya a dividir o no depende de dos tipos de factores: internos y externos. Los factores internos que pueden impedir el avance del ciclo celular son, por ejemplo, daños en el ADN, tamaño celular insuficiente, falta de moléculas para la siguiente fase, longitud de los telómeros, etcétera. Cualquiera de estos fallos lleva a que el punto de control no se pase.
Una célula animal sana se divide si recibe una serie de señales de su entorno, las cuales suelen actuar a nivel del punto de control G1/S. Estas señales son proteínas que liberan otras células, y que se pueden ser mitógenos, factores de crecimiento y factores de supervivencia. Cada uno de ellos tiene su función en diferentes aspectos del avance del ciclo celular, y si están ausentes la célula no pasará el punto de restricción G1/S.
Hoy en día se acepta que el tamaño celular depende de una serie de factores internos y externos. Esto podría ser mediante la regulación de la longitud de la fase G1. Es decir, hay una relación entre la longitud del ciclo celular y el tamaño celular. Durante la fase G1, CDK4 parece estar ligada al control del tamaño celular.
Punto de control G1/S
El paso de la fase G1 a la fase S supone una decisión importante para la célula puesto que implica el comienzo de la replicación del ADN, y a continuación vendrán todas las siguientes fases del ciclo celular. Por eso a este punto se le llama punto de restricción. Durante la fase G1 se comprueba la cantidad de mitógenos que recibe la célula, si hay factores de supervivencia, si hay aporte de nutrientes, y otras señales del ambiente. Además, atiende también a señales internas como integridad del ADN o estado metabólico, tamaño celular y otros. Si todo es correcto se pasará este punto de control, pero si no es así el ciclo celular se detiene. Empezada la fase S, el ciclo celular ya no dependerá de señales externas para continuar. No hay que considerar al punto de control G1/S como un momento determinado, sino como un intervalo de tiempo en el que decide si el ciclo celular se detiene o no. En células de ratón, el punto de control G1/S está a unas dos o tres horas antes de empezar con la replicación del ADN.
Las enzimas CDK4 y CDK6 han de estar activas durante la fase G1 para llegar hasta el punto de control G1/S. En realidad CDK4/6 se expresan a lo largo de todo el ciclo celular, pero sólo están activas durante G1 si se cumplen unos determinados requisitos (Figura 3). Así, la actividad de CDK4/6 es dependiente de la ciclina D y La concentración de la ciclina D es dependiente a su vez de la presencia estímulos externos, tales como factores de crecimiento y citocinas, entre otros. Es decir, la ciclina D es un sensor del ambiente celular. Esto no ocurre con otras ciclinas. Sin embargo, la unión de la ciclina D a CDK4/6 no es suficiente para la activación de éstas. Se necesita además que CDK4/6 estén fosforiladas en un sitio determinados por una enzima llamada CAK (“CDK activating kinases”) y ser defosforiladas en otro sitio de la molécula por la fosfatasa CDC25A. Por último, es necesario eliminar el freno provocado por la presencia de inhibidores. Hay dos tipos de inhibidores: CIP/KIP e INK4. CIP/KIP son las proteínas p21, p27 y p57, y son inhibidores universales de CDKs. INK4 son las proteínas p15, p16, p18 y p19, y sólo inhiben a CDK4/6. Estos últimos se unen a la CDK4/6 e impiden que se una a la ciclina D.
Una vez llegados al punto de control G1/S han de ocurrir dos cosas para pasarlo y continuar con el ciclo celular: la hiperfosforilación de la proteínas retinoblastoma y la degradación de la proteína APC/C (“anaphase promoting complex/cyclosome”).
La proteína retinoblastoma tiene 15 sitios de fosforilación. Cuando no está defosforilada, o fosforilada sólo en un sitio, se une al factor de transcripción E2F, secuestrándolo e impidiendo la expresión de muchos genes (E2F comprende en realidad a 5 moléculas, de E2F1 a E2F5). Ver la Figura 5. Cuando se inicia la fase G1 retinoblastoma no está fosforilado. A medida que avanza G1, las CDK4/6-D (CDK unidas a la ciclina D) fosforilan a retinoblastoma en un solo sitio, lo cual es necesario, pero no suficiente, para liberar a E2F. Sin embargo, la acción de las CDK4/6 permite que se active la CDK2, la cual, en conjunción con la ciclina E, termina de hiperfosforilar a retinoblastoma. Esto hace que E2F quede totalmente libre y se favorezca la expresión de una serie de genes que son necesarios para que se inicie y desarrolle correctamente la fase S. Existe otro complejo molecular denominado DREAM, formado por una proteína similar a retinoblastoma (RBL1 o RBL2), E2F4 (o E2F5) y las proteínas DP y MUVB. El complejo DREAM tiene un papel redundante con retinoblastoma-E2F, y lleva a cabo funciones similares. Esta vía de activación del ciclo celular por hiperfosforilación de retinoblastoma se ha aceptado hasta ahora como la más plausible, pero nuevos datos indican que podría ser de otra manera. Así, es posible que CDK4/6-D sean capaces de hiperfosforilar por si solas a retinoblastoma y CDK2-E participaría en mantenerla hiperfosforilada, o que sean CDK4/6-D las que activen por otro camino diferente CDK2-E y sea esta la verdadera encargada de hiperfosforilar a retinoblastoma.
La proteína APC/C es una ligasa de ubiquitina que degrada, entre otras, a la ciclina A. Esta ciclina es necesaria para la actividad de la CDK2 durante la fase S. Si no hay ciclina A no se desarrolla la fase S. APC/C necesita de la proteína Cdh1 para estar activa. Hay dos maneras de inhibir a las proteína Cdh1, y por tanto a la APC/C: mediante el inhibidor Em1 (“early mitotic inhibitor”), inducido por la E2F, y mediante la actividad de CDK2-E. Una vez activada APC/C aumentan los niveles de ciclina A, la cual es necesaria para CDK2 (Figura 4).
La inactivación de retinoblastoma y de APC/C son procesos independientes y a distintos tiempos. Las dos cosas son necesarias para el avance del ciclo y por tanto se habla de una ventana de restricción más que de un punto de restricción.
La transición entre G1 y S está desregulada en células cancerosas. Se produce un defecto en retinoblastoma o una activación permanente de las CDKs. De hecho hay terapias aprobadas contra el cáncer en las cuales de añaden inhibidores de CD4/6 y han sido los primeros fármacos aprobados contra el cáncer que atacan este punto de control. Retinoblastoma fue el primer gen supresor de tumores identificado. Un gen supresor de tumores es aquel que evita que avance el ciclo celular cuando la célula está dañada o es potencialmente peligrosa, pudiendo convertirse en una célula cancerosa. El gen que codifica la proteína retinoblastoma está mutado en numerosos tipos de tumores. Además de permitir el avance del ciclo celular sin control, la mutación en retinoblastoma impide que la célula abandone el ciclo celular o que entre en estado senescente.
Pero, como dijimos, la mayoría de las células de un organismo adulto no están en permanente proliferación. Así, hay inhibidores que se activan cuando algo ha ido mal en G1 o en la fase M, o simplemente cuando la célula tiene que abandonar el ciclo celular. Por ejemplo, cuando hay daño del ADN celular, otro tipo de estrés celular, cambios de pH u otras alteraciones celulares, aumenta la concentración de un factor de transcripción denominado p53. Su expresión provoca la expresión del gen p21, el cual a su vez impide la fosforilación de retinoblastoma, puesto que es un inhibidor de todas las quinasas que fosforilan a retinoblastoma, y por tanto la célula no comienza la fase S. p53 es un factor de transcripción cuyo gen está mutado en numerosos tipos de cánceres, es un gen supresor de tumores. Otro elemento aparentemente clave para detener el ciclo celular en G1 es la degradación de la ciclina D.
Hoy se sabe que existen al menos otros tres puntos de control, además del próximo a la fase S, que afectan al avance de la fase G1. El primero está al principio de la fase G1, en las células recién formadas, donde se comprueba si retinoblastoma está hiperpolarizada. Esta hiperfosforilación se da en la fase M de la célula madre y siempre que haya presencia de mitógenos. Hay un segundo punto para aquellas células que entran en G0, donde la célula se detiene, e intenta hiperfosforilar de nuevo a Rb. Por último, hay otro punto que se encuentra al final de G1 donde se comprueba que no hay daños en el ADN. Si los hay, la célula no entra en la fase S.
Punto de control S
Durante la fase S del ciclo celular se tiene que preservar la regla “una célula, una copia de ADN” y por tanto el ADN se tiene que replicar una sola vez. Además, no debe haber errores durante la replicación puesto que éstos pasarían a las células hijas. La replicación está muy bien regulada gracias a los denominados orígenes de replicación, que son los puntos donde se comienza a replicar el ADN. Hay muchos orígenes de replicación potenciales en el ADN de eucariotas, y sólo un porcentaje se activa en cada ciclo celular. En cada uno de estos orígenes de replicación se abre la doble hélice y se crean dos horquillas de replicación que avanzan en sentido contrario replicando el ADN simultáneamente. Cuando dos horquillas que van en sentido contrario se encuentran se produce un evento denominado terminación.
Cuando la replicación en alguna horquilla de replicación se detiene (se atasca) se pone en funcionamiento del punto de control de la replicación de la fase S. Cuando lo que ocurre es un daño en el ADN se activa otro punto de control, punto de control del daño en el ADN. Ambos están relacionados porque comparten elementos moleculares.
La enzima quinasa ATR se une a horquillas de replicación detenidas, donde se activa y fosforila a muchas proteínas, incluida la quinasa Chk1, y otras muchas proteínas que inhibirán el inicio de la replicación en los orígenes de replicación que se tendrían que activar al final de la fase S, Todas estas proteínas tienen como misión estabilizar las horquillas de replicación detenidas para que se reinicie la replicación del ADN en ellas. La activación de este punto de control necesita también de la participación de la proteína claspina, la cual se encuentra en la horquilla, incluso si está funcionando bien.
Punto de control G2/M
Durante la fase G2 se tienen que preparar aquellas herramientas moleculares necesarias para la mitosis y que tendrán que actuar de una manera coordinada. Hay que tenerlas sintetizadas y listas para actuar. Además, la fase G2 es una sala de espera donde se comprueba si se han producido fallos en la replicación durante la fase S. El bloqueo del ciclo celular en G2, el punto de control, se debe sobre todo a la inhibición de la actividad de CDK1-B (cuya actividad inicia la fase M). CDK1 tiene una concentración estable durante el ciclo celular, pero no la ciclina B, necesaria para su actividad.
La síntesis de ciclina B es máxima durante la fase G2. Su degradación empieza en metafase y continúa a lo largo de G1. La eliminación de la ciclina B es necesaria para acabar la fase M, y su degradación está mediada por el complejo APC. CDK1, además de unirse a la ciclina B, tiene que ser fosforilada por CAK para activarse. La actividad de CDK1-B está inhibida por la quinasa WEE1, ya que fosforila CDK1-B y la mantiene inactiva. Antes del inicio de la fase M, la fosfatasa CDC25 elimina este fósforo inactivador, produciéndose así la activación de CDK1-B. Es un mecanismo de encendido y apagado. Por otro lado CDK1-B fosforila WEE1 y CDC25, inhibiendo y activando respectivamente, con lo cual se asegura seguir estando activa.
Cuando se han producido daños en el ADN durante la fase S son detectados por el complejo MRN (Mre11, Rad50 y NBs1). MRN atrae a una exonucleasa, al complejo proteico RPA, y este aATR. ATM es otro componente proteico activado por MRN. ATM y ATR fosforilan y activan a CHK1 y CHK2. Todas estas enzimas son quinasas y están involucradas en el punto de control G2/M y una vez puestas en marcha se produce una cascada de señalización que impide el inicio de la fase M. Por ejemplo, la CDC25, fosfatasa que activa a CDK1-B, es fosforilada e inhibida por ATR. ATM y CHK1 y CHK2. Si el daño no se repara se activa el factor p53 que inicia la muerte celular por apoptosis. (Figura 6)
Una vez que el daño en el ADN se ha reparado, se activan fosfatasas que revierten todos los cambios producidos por las quinasas. Sin embargo, se ha observado que en algunas células aunque pase demasiado tiempo y el daño no se repare, las fosfatasas se activan de igual modo, el punto de control se deshace y la célula continúa el ciclo celular, independientemente del daño. Este mecanismo se cree que ocurre porque la célula "decide" continuar e intentar reparar los daños, o morir, tras la división antes de quedar permanentemente en G2.
Punto de control M
El punto de control del ensamblaje del huso (SAC: "spindle assembly checkpoint") sólo está activo en prometafase y hasta el comienzo de la anafase. Aquí se asegura la célula de que todos los cromosomas están conectados por microtúbulos provenientes de los dos polos y están bien alineados en la placa de metafase, antes de ser separados en la anafase. Este punto de control previene aberraciones cromosómias: delecciones, trisomías, translocaciones, etc. La profase debe durar los suficiente para que los microtúbulos encuentren a los cinetocoros, lo que es un proceso estocástico. Si la anafase ocurre demasiado pronto se pude producir una segregación errónea de cromosomas.
La segregaciónn de los cromosomas está medidada por los microtúbulos provenientes de los dos polos del huso mitótico unidos a cinetocoros, los complejos proteicos que se ensamblan en torno a los centrómeros. La anafase no comienza hasta que todos los cinetocoros están unidos a sus microtúbulos y alineados en metafase. Si todo está correcto el sistema de control que previene la segregación de las cromátidas se apaga. Si los defectos del huso son muy grandes y no se alcanza una metafase apropiada la célula entra en apoptosis.
Cuando hay cinetocoros que no han sido contactados por parte de los microtubulos varias proteínas del propio cinetocoro se reclutan al cinetocor una serie de proteínas que forma en llamado SAC, el cual es liberado del cinetocoro y se une a APC/C inhibiéndola. APC/C deja entonces de degradar a la securina y a la ciclina B. Estas dos molécula favorecen la anafase. La securina se une e activa a la separasa, la cual degrada las proteinas SCC1 que forma las conexiones entre las dos cromátidas de cada cromosoma. Al degradar a la ciclina B, inactiva a la CDK1-B la cual inhibe por fosforilación a la separasa. (Figura 7).
El núcleo del complejo APC/C está formado por 14 proteínas, algunas con varias copias que se ensamblan para formar un enorme complejo de 1.2 MDa. Este complejo se asocia con otras proteínas activadoras que son las responsables de seleccionar los sustratos para ubiquitinizar. Al final de la mitosis la fosfatasa CDC14 defosforila a Cdh1 y la activa. ACP/C-Cdh1 conduce a la célula durante la terminación de la mitosis y juega un papel importante durante la fase G1.
Bibliografía
Brown A, Geiger H. 2018. Chromosome integrity checkpoints in stem and progenitor cells: transitions upon differentiation, pathogenesis, and aging. Cellular and molecular life sciences. 75:3771–3779.
Ciardo D , Goldar A, Marheineke K. 2019. On the interplay of the DNA replication program and the intra-S phase checkpoint pathway. Genes. 10, 94. doi:10.3390/genes10020094.
Engeland, K. 2022. Cell cycle regulation: p53-p21-RB signaling. Cell death & differentiation. 29:946–960. https://doi.org/10.1038/s41418-022-00988-z.
Hernández-Carralero E, Cabrera E, Alonso-de Vega I , Hernández-Pérez S, Smits VAJ, Freire R. 2018. Control of DNA replication initiation by ubiquitin. Cells. 7, 146. doi:10.3390/cells7100146.
Kernan J, Bonacci T, Emanuele MJ. 2018. Who guards the guardian? Mechanisms that restrain APC/C during the cell cycle. BBA - Molecular cell research. 1865: 1924–1933.
Lara-González P, Pines J, Desai A. 2021. Spindle assembly checkpoint activation and silencing at kinetochores. Seminars in cell and developmental biology. 117: 86-98.
Pennycook BR, Barr AR. 2020. Restriction point regulation at the crossroads between quiescence and cell proliferation. FEBS letters. 594: 2046–2060 doi:10.1002/1873-3468.13867.
Rubin SM, Sage J, Skotheim JM. 2020. Integrating old and new paradigms of G1/S control. Molecular cell. 80: 183-192. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2020.08.020
Yam CQY, Lim HH, Surana U. 2022. DNA damage checkpoint execution and the rules of its disengagement. Frontiers in cell and developmental biology. 10:1020643. doi: 10.3389/fcell.2022.1020643.
Zaveri L, Dhawan, J. 2018. Cycling to meet fate: connecting
pluripotency to the cell cycle. Frontiers in cell and development biology. 6, 146.