Atlas de histología vegetal y animal

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Técnicas histológicas.

2. FIJADORES

Resumen Medio
Índice de esta página
1. Simples
2. Mezclas

Los fijadores químicos son los más empleados, y están compuestos por un solo tipo de sustancia fijadora o por una mezcla de varios de ellos. Los fijadores se pueden clasificar en coagulantes y en aquellos que establecen enlaces cruzados. Los primeros, al extraer agua de los tejidos producen coagulación y desnaturalización de las proteínas, mientras que los segundos establecen enlaces químicos entre moléculas del tejido. Los fijadores que tienen como base al alcohol son coagulantes, tales como el Bouin o el Carnoy, mientras que el formaldehído o el glutaraldehído establecen enlaces cruzados. Se pueden preparar soluciones mixtas de ambos tipos de fijadores.

1. Fijadores simples

Etanol (Figura 1), metanol, acetona. Fijan por deshidratación y coagulación de las proteínas, sobre todo las citosólicas. Extraen los lípidos de los tejidos, pero no afectan a los carbohidratos. En general, son buenos fijadores de muestras de pequeño tamaño, preservan el glucógeno, los pigmentos y las proteínas, como las enzimas. Se usan frecuentemente para para fijar las extensiones citológicas o secciones de criostato obtenidas de tejido no fijado. También como un conservantes de las muestras. Pueden producir endurecimiento y retracción de los tejidos, muy evidentes en bloques de tejido muy grandes. Carecen de efecto mordiente.

Etanol
Figura 1. Etanol
(CH3CH2OH)

Ácido acético (Figura 2). Su proceso de fijación consiste en cambiar el estado coloidal de las proteínas. Se utiliza a una concentración que varía entre el 1 y el 5 %. Es el fijador ideal para ácidos nucleicos y nucleoproteínas. Como inconvenientes cabe destacar la destrucción de las mitocondrias y mala fijación de las membranas y el citoplasma. Se suele usar en combinación con otros fijadores como en el Bouin y FAA (formaldehído, alcohol, acético).

ácido acético
Figura 2. Ácido acético
(CH3COOH)

Ácido pícrico (Figura 3). Las sales del tipo picrato coagulan las proteínas de los tejidos. Preservan bien la estructura celular, no producen retracciones cuando el tiempo de fijación es óptimo y preservan bien glucógeno y lípidos. El ácido pícrico es un buen fijador para tinciones generales puesto que tiene efecto mordiente y favorece la unión de los colorantes. Se suele usar combinado con otros fijadores, como en el Bouin.

ácido pícrico
Figura 3. Ácido pícrico
(C6H2OH(NO2)3)

Formaldehído (Figuras 4 y 5). Es un fijador ampliamente usado por la buena preservación del tejido, actúa como conservante, produce poca retracción tisular, es compatible con la mayoría de las tinciones histológicas, incluidas las de inmunocitoquímica e hibridación de ácidos ribonucleicos. El formaldehído preserva bien los lípidos, sobre todo si se añade a la solución fijadora iones de calcio (reducen la solubilidad de los fosfolípidos), y no reacciona con los carbohidratos. Normalmente se usa en solución tamponadora de pH e isotónica. Se utiliza a concentraciones próximas al 4 %. Por ejemplo, en el formaldehído tamponado, en el Bouin, FAA y PLP.

Formaldehído
Figura 4. Formaldehído
(CH2=O)
Formaldehído
Figura 5. Enlaces entre proteínas formadas por el formaldehído.

Glutaraldehído (Figura 6). Es uno de los fijadores más usados. En solución polimeriza formando dímeros y trímeros. El glutaraldehído tiene poca velocidad de penetración y forma puentes entre las moléculas de los tejidos. Tiene una alta capacidad para preservar la estructura celular puesto que es capaz de entrelazar el tejido más fuertemente que otros aldehídos, por lo que es el fijador de referencia para la observación ultraestructural de las células con el microscopio electrónico. Sin embargo, no se recomienda para inclusiones en parafina. Se usa en soluciones tamponadoras isotónicas y normalmente en combinación con el formaldehído.

Glutaraldehído
Figura 6. Glutaraldehído.

Tetróxido de osmio (Figuras 7 y 8). Tiene poca penetración en las piezas de tejido, entre 0.5 y 1 mm, y se puede usar tanto en solución como en vapor. No produce artefactos pero hace a las muestras de tejido frágiles. Forma puentes entre los enlaces insaturados de las cadenas de ácidos grasos de los lípidos de las membranas celulares, a las que hace insolubles, oscuras y opacas a los electrones. Por eso se emplea habitualmente para las observaciones con el microscopio electrónico, ya que preserva y oscurece las membranas celulares. Pero también en microscopía óptica se usa para estudiar las grasas insaturadas, para observar los tractos de mielina, y es necesario para las impregnaciones argénticas como en el método de Golgi.

Tetróxido de osmio
Figura 7. Tetróxido de osmio. OsO4.
Tetróxido de osmio
Figura 8. Enlaces producidos por el OsO4 en los enlaces insaturados de los ácidos grasos.

2. Mezclas fijadoras

Líquido de Bouin. Está formado por ácido pícrico, formaldehído y ácido acético glacial. Es una solución muy utilizada para el procesamiento de tejidos que se incluirán en parafina (ver capítulo de inclusión) y a cuyas secciones se les puede aplicar un amplio espectro de tinciones. Hay que tener cuidado con el tiempo de fijación, que no debe exceder de 48 h en el caso de fijaciones por inmersión. Tras la fijación las muestras de tejido se pueden conservar en etanol de 70°.

Solución de Clarke. Está formada por etanol y ácido acético glacial (3:1). Es uno de los primeros fijadores que se empleó para muestras que se incluían en parafina.

Carnoy. Es un buen fijador para el glucógeno, para los hidratos de carbono simples y para las proteínas fibrosas. Es bueno para observar los ácidos nucleicos, aunque no la morfología nuclear, y para los grumos de Nissl del sistema nervioso. Puede producir retracciones tisulares. Está formado por etanol absoluto 60 %, cloroformo 30 % y ácido acético glacial 10 %.

Mezclas con formaldehído. El formaldehído es quizá el fijador más usado hoy en día. Lo más frecuente es utilizarlo en solución al 4 % junto con otros fijadores. Se suele disolver en soluciones tamponadoras que tienen una osmolaridad similar a la del tejido que se pretende fijar. Para fijaciones de tejidos destinados a microscopía electrónica se suelen utilizar soluciones fijadoras que contienen formaldehído y glutaraldehído. La función del formaldehído es iniciar una fijación rápida, por su mayo capacidad de penetración, mientras que el glutaraldehído realizará una fijación más poderosa, pero más lenta, que no afectará a la estructura tisular puesto que el formaldehído ya ha realizado una fijación previa. Ejemplos: formaldehído tamponado , Bouin, FAA, PLP.

Glutaraldehído-tetróxido de osmio. Los fijadores en combinación no tienen necesariamente que usarse al mismo tiempo. Es habitual que los tejidos destinados a microscopía electrónica sean inicialmente fijados en glutaraldehído (1 al 3 %) y paraformaldehído (2 al 4 %), para posteriormente ser postfijados en tetróxido de osmio al 1 % en solución tamponadora.



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