Cuando se quieren observar estructuras celulares que están por debajo del límite de resolución del microscopio óptico, como algunos orgánulos, membranas, estructuras citosólicas, complejos moleculares de la matriz extracelular o virus, se recurre al microscopio electrónico. Se inventó en la primera mitad del siglo XX, el primer prototipo de microscopio electrónico de transmisión fue construido por Ruska en 1933, y su aplicación a la histología desveló las estructuras celulares más pequeñas denominadas en su conjunto ultraestructura celular. Por tanto, observar ultraestructuralmente a la célula significa observarla con el microscopio electrónico. Este tipo de microscopio tiene un límite de resolución más pequeño que 1 nanómetro gracias a que no usa la radiación electromagnética de la luz visible sino la alta frecuencia de un haz de electrones que incide sobre la muestra, y permite aumentos de varios millones de veces en los microscopios electrónicos tradicionales. Los nuevos microscopios de transmisión son capaces de distinguir entre átomos y llegar a aumentos de 50 millones de veces. Actualmente, en las preparaciones histológicas, lo que limita la claridad de las imágenes es la preparación de las muestras más que la capacidad del propio microscopio. Los microscopios electrónicos son capaces de resolver estructuras moleculares y están siendo muy útiles para estudiar la conformación tridimensional de la cadena de aminoácidos en las proteínas.
El microscopio electrónico no usa lentes sino imanes que concentran los haces de electrones emitidos por un filamento. Estos imanes electromagnéticos sirven para concentrar más o menos los haces de electrones. Los cambios de aumentos se consiguen variando la velocidad de los electrones, con lo que también varía la frecuencia de onda de éstos.
Normalmente son aparatos grandes puesto que el viaje de los electrones tiene que ocurrir en vacío, si no los electrones chocarían con las partículas del aire. Por eso, tienen grandes tubos dentro de los cuales se crea y manipula el haz de electrones y donde se colocan las muestran para su observación.
En histología se usan dos tipos de microscopios electrónicos: de transmisión y de barrido.
1. Microscopio electrónico de transmisión
En este tipo de microscopio electrónico se produce el haz de electrones en un filamento de tungsteno que funciona como cátodo (Figura 1). Los electrones se condensan mediante electroimanes y se focalizan sobre una sección de tejido. Las secciones de tejido deben ser muy finas, se denominan ultrafinas (de unas decenas de nanómetros), para permitir que sean atravesadas por los electrones y para conseguir imágenes nítidas. Previamente las secciones deben ser tratadas con metales pesados como el osmio, el plomo y el uranilo. La función de estos metales es similar a las tinciones usadas en el microscopio óptico, dar color a las estructuras celulares, pero sólo en tonalidades de grises. Estos metales se concentran fundamentalmente en membranas y en los complejos macromoleculares. Los electrones que chocan con estos metales rebotarán y no cruzarán el tejido. Aquellos que consigan atravesar el tejido impactararán contra una pantalla fluorescente que emitirá un destello luminoso tras cada choque. Esa imagen emitida por la pantalla fluorescente es la que podemos observar nosotros. Por ello las imágenes observadas con el microscopio electrónico son siempre en blanco y negro (con tonalidades de grises) (Figura 2), aunque posteriormente se pueden colorear con un ordenador.
2. Microscopio electrónico de barrido
Los microscopios electrónicos de barrido sirven para observar superficies tisulares. Ello es posible porque los electrones no atraviesan la muestra sino que interaccionan con su superficie y rebotan. Para que esto ocurra hay que cubrir a la muestra con una máscara de metales que se adapta perfectamente al relieve de la muestra. La muestra se barre con el haz de electrones y los electrones reflejados por un punto de la superficie son captados por una pantalla receptora que creará una imagen en una pantalla digital. La imagen completa se formará cuando el haz recorra toda la superficie de la muestra y se consiga información de cada uno de los puntos. Es decir, se escanea la muestra, y de ahí el nombre de microscopio de barrido, o en inglés "scannig". La resolución del estos microscopios es un orden de magnitud menor que el de transmisión.
Por supuesto, las muestras que se observan no son secciones, sino porciones de órganos con superficies de interés. Se pueden observar superficies de secciones hechas con un vibratomo o con un microtomo de congelación, pero no aquellas que han sido incluidas en resina o parafina. Ya que sólo rastrea superficie se pueden estudiar muestras de tejido mucho más grandes y gruesas. Aunque la imagen se ve en una pantalla, y por tanto es bidimensional, el juego de sombras creado por la emisión de electrones da una idea tridimensional de la muestra (Figura 3). Es como si se le hiciera una foto.
3. Otros
La microscopía electrónica de transmisión permite ver la ultraestructura celular, pero en dos dimensiones. Sin embargo, una visión tridimensional a escalas nanométricas aporta mucha más información. Hay una variante de la microscopía electrónica de transmisión que se denomina tomografía electrónica, que cosiste en tomar imágenes de una sección pero inclinando un ángulo determinado la sección respecto al haz de electrones en cada fotografía. Después, todas las imágenes se procesan digitalmente mediante un proceso de reconstrucción en 3D. De esta manera se consiguen imágenes tridimensionales de estructuras subcelulares.
La tomografía electrónica por congelación es una técnica que consiste en la congelación ultrarrápida de una muestra de células o tejidos. La congelación es tan rápida que el agua no se ordena en cristales de hielo, y por tanto se preservan las características de las estructuras celulares y moléculas. Luego, las muestras se retallan hasta un grosor y dimensiones adecuados, y posteriormente se observan al microscopio electrónico. La observación también se produce a temperaturas muy bajas (menos de 150 o 180 ºC) en unos dispositivos ultrafríos en el interior del microscopio electrónico. La congelación preserva la muestra en su estado hidratado original. En el microscopio electrónico se toman muchas imágenes de la misma muestra, pero inclinándola un poco en cada una de ellas. Todas las imágenes se unen en una sola imagen tridimensional reconstruida mediante un programa informático. Esta técnica se aplica mucho en la determinación de la estructura tridimensional de las proteínas usando microscopios electrónicos de gran resolución.
Microscopio óptico