La actividad NADPH-diaforasa es el nombre genérico que se aplica para cualquier enzima con la capacidad de transferir electrones entre el NADPH o NADH y distintos aceptores, entre los que se encuentran las sales de tetrazolio. Las sales de tetrazolio reducidas forman moléculas insolubles y azuladas llamadas formazanos. Así, esta técnica pone de manifiesto cualquier deshidrogenasa que utilice NADPH como donador de hidrógenos y sales de tetrazolio como aceptor. Por ejemplo, se ha usado para poner de manifiesto la succinato deshidrogenasa.
En el sistema nervioso central esta técnica pone de manifiesto diversas poblaciones de neuronas que expresan la enzima óxido nítrico sintasa neuronal, la cual produce óxido nítrico, considerado como un neurotransmisor atípico. Pero también detecta la enzima óxido nítrico sintasa endotelial en los vasos sanguíneos del encéfalo. Por tanto estas enzimas poseen activada deshidrogenasa. La equivalencia entre la expresión de la enzima óxido nítrico sintasa y la actividad NADPH-diaforasa ha permitido estudiar estas poblaciones neuronales productoras de óxido nítrico de una manera sencilla y rápida. Aunque hay que tener precaución en la interpretación de los resultados, puesto que el resultado de la técnica depende en cierta medida del fijador y proceso de fijación de la muestra.
Procedimiento
Partimos de cortes de material fijado con paraformaldehído al 4 %. Los cortes se obtienen mediante vibratomo o por congelación.
1. 2x10 min en tampón fosfato 0.1 M pH 7.4 (PB).
2. 2x10 min en PB con Triton X-100 al 0.3 % con agitación.
3. 10 min en PB + 0.3 % de Triton X-100 + NADPH (0.5 mg/ml) + Nitro azul de tetrazolio (0.2 mg/ml).
Incubación con agitación
A temperatura ambiente
Protegido de la luz
4. 2-6 horas a 37 ºC en la solución del paso 3.
5. Parar el revelado con lavados en PB
6. Deshidratar y montar.
Si los cortes son de vibratomo en flotación han de pegarse tras el revelado sobre portas recubiertos con gelatina. Se pueden usar pinceles para la manipulación de los cortes.
Resultados
Neuronas, prolongaciones nerviosas: azul.
Vasos sanguíneos: azul.
Consejos
Si los cortes no se lavan bien tras la fijación los resultados pueden no ser adecuados.
Si el proceso de revelado es muy largo puede aparecer precipitado de formazano. Esto se puede evitar sustituyendo la solución de revelado por otra fresca cuando la solución de revelado adquiera un color púrpura intenso.
Productos
Xileno
Etanol de 50º, 70º, 80º, 90º, 96º y 100º
Nitro azul de tetrazolio
NADPH
Tampón fosfato 0.1 M pH 7.4
Triton X-100
H2O destilada
Medio de montaje
Material
Cubetas de tinción
Filtro de papel
Pincel
Papel de aluminio
Agitado orbital
Estufa a 37 ºC
Portas recubiertos de gelatina
Cubreobjetos
