La observación de las neuronas tiene la complicación de que es muy difícil poner de manifiesto sus árboles dendríticos y axónicos. Mediante la técnica de Golgi, que es un impregnación de plata, se pueden observar neuronas individuales, tanto el soma como sus dendritas y axones. Esta técnica tiene la peculiaridad de que sólo revela un pequeño porcentaje de las neuronas, con lo cual se pueden estudiar de manera prácticamente individualizada. También es capaz de impregnar a los astrocitos. La base química de esta reacción es desconocida, así como el porqué unas neuronas se impregnan y otras no. Esta técnica permitió observar por primera vez la morfología de las neuronas.
La impregnación de Golgi se aplica a bloques de tejido nervioso relativamente gruesos (0,5 a 1 cm aproximadamente). A continuación describimos una adaptación de esta técnica a cortes gruesos de unos 100 µm de grosor.
Procedimiento
Partimos de cerebros o médula espinal que han sido fijadas preferentemente con paraformaldehído tamponado al 4%. El tejido se corta en un vibratomo en secciones de 100 a 300 µm de grosor. Los cortes se usan en flotación y pueden quedar en nevera durante días antes de su uso.
1. 10 min tetróxido de osmio al 1 % en tampón fosfato (PB 0.1 M, pH 7.3)
El tetróxido de osmio es muy tóxico y volátil, luego su manejo ha de hacerse en campana extractora y con guantes. Una vez usado es necesaria su inactivación con aceite de maíz.
2. 2 x 10 min en PB.
3. 2 - 3 horas en dicromato potásico al 3.5 % en H2O destilada.
4. Montado de los cortes en un portaobjetos con un pincel.
5. Eliminación del exceso de dicromato potásico con un papel del filtro, sin que el corte se llegue a secar.
6. Colocación de un cubreobjetos sobre la sección procurando que no queden burbujas entre el cubre y la superficie de la sección.
7. Añadir entre el portaobjetos y el cubreobjetos, por capilaridad, nitrato de plata al 1.5 % en H2O destilada. La solución debe tocar los bordes del corte, pero no las superficies de corte.
Con una micropipeta se añaden lentamente gotas de la solución de manera que se extiendan por capilaridad.
8. Colocar en cámara húmeda y en oscuridad hasta la aparición de las neuronas impregnadas.
El tiempo de impregnación es variable y puede durar desde varias horas hasta uno o dos días. De cualquier manera el desarrollo de la reacción se puede controlar con el microscopio y se detiene cuando se estime oportuno.
9- Se quita el cubreobjetos y las secciones se añaden a un pocillo con H2O destilada donde se lavan removiéndolas con un pincel. La secciones irán ahora en flotación.
10. Deshidratación muy rápida. Varios segundos en etanol de 50º, 80º 96º y 100º
Para que la impregnación se mantenga intensa y duradera es preciso hacer una deshidratación rápida, aunque no debe quedar agua. Tras ello se incluyen las secciones en resinas de tipo epoxy empleadas en las técnicas de microscopia electrónica.
11- 2x5 min en óxido de propileno.
12- Resina tipo epoxy toda la noche a temperatura ambiente.
13. 48 h polimerización a 60 ºC.
Las secciones se colocan sobre un portaobjetos, se añade la resina y se cubren con un cubreobjetos. Se pueden colocar algo de peso sobre el cubreobjetos para que las secciones queden bien estiradas.
Resultados
Neuronas: marrón oscuro a negro.
Astrocitos: marrón oscuro a negro.
Resto de tejido. marrón muy claro, anaranjado pálido.
Vasos sanguíneos: a veces se marca el endotelio de color oscuro.
Consejos
El tiempo en tetróxido de osmio parece afectar a la cantidad y rapidez de neuronas marcadas pero es variable para cada muestra.
Es importante que la solución de nitrato de plata sea transparente, nada de turbidez, lo que indica que la solución está en buen estado.
La permanencia prolongada en los alcoholes durante la deshidratación (más de dos o tres minutos) atenúa el marcaje
El montaje con medios de montaje convencionales usados tras el xileno no permite la perdurabilidad de la impregnación y termina por desvanecerse.
Productos
Etanol de 50º, 70º, 80º, 90º, 96º y 100º
Tetróxido de osmio
Dicromato potásico
Nitrato de plata
Resina tipo epoxy
H2O destilada
Material
Cámara húmeda
Cubreobjetos
Papel de filtro
Pinceles
Estufa a 60 ºC
Aceite de maíz
