La obtención de secciones finas, entre 5 y 15 μm, sólo se puede conseguir a partir de tejido endurecido, pero no frágil. Esto es posible mediante la congelación de las muestras o mediante su inclusión en determinados medios. Incluir significa infiltrar el tejido con un medio líquido que posteriormente se solidificará y endurecerá sin afectar, o afectando mínimamente, a las características del la muestra.
El medio de inclusión más usado para obtener secciones finas es la parafina. La parafina es una mezcla de hidrocarburos que cuando solidifica tiene aspecto de cera de vela. Hay distintos tipos de parafinas que se diferencian en la longitud de las cadenas de las sustancias carbonadas, lo cual determina sus puntos de fusión. Éstos suelen oscilar entre los 45 ºC y los 60 ºC.
Procedimiento
Fijación (recomendados formol, Bouin o FAA: formaldehído/acético/alcohol).
Selección de la muestra: 0.5 cm de tamaño aproximadamente.
Deshidratación de las muestras: etanol.
Este paso es necesario puesto que la parafina no es miscible con el agua y por tanto la muestra ha de estar libre de agua.
3x10 min H2O destilada
4x10 min etanol 70º
4x10 min etanol 80º
4x10 min etanol 90º
4x10 min etanol 96º
5x10 min etanol 100º
Solvente orgánico: xileno
La parafina tampoco es miscible con el alcohol por lo que se requiere este paso puente con un solvente orgánico. El xileno es miscible tanto con el etanol de 100º como con la parafina.
4x5 min xileno
Parafina líquida (en estufa a 60 ºC).
60 min parafina I
60 min parafina II
60 min parafina III
Colocar parafina líquida en un molde metálico, fuera de la estufa, e introducir la muestra en él con la orientación deseada. Dejar enfriar a temperatura ambiente.
Consejos
Fijación: el tejido ha de estar fijado antes de empezar el proceso de inclusión. Se pueden usar muchos tipos de fijadores, pero los más comunes son aquellos basados en formaldehído, como el propio formol, el BOUIN, o para plantas el Carnoy, Karnovsky o FAA. No suelen ser buenos los fijadores que contienen glutaraldehído.
Selección de la muestra: no se recomienda la inclusión de piezas con dimensiones superiores a 1 cm puesto la difusión de los líquidos será más lenta. Los tiempos de deshidratación, xileno y embebimiento en parafina se adapatarán al tamaño de la muestra. Más tamaño más tiempo.
Selección de la muestra: en el caso de muestras duras hay que hacer tratamientos previos. Por ejemplo, los huesos requieren un tratamiento de descalcificación antes de comenzar las deshidratación.
Deshidratación: en caso de fijadores con ácido pícrico es importante que los primeros pasos entre el H2O destilada y el etanol de 96º se extiendan hasta que el color amarillo haya desaparecido prácticamente.
Deshidratación: si es posible, los pasos de deshidratacón y también el de xileno han de hacerse con el recipiente en agitación. El movimiento de la muestra dentro de cada líquido favorece los procesos de difusión entre el interior y el exterior de la muestra.
Encastramiento: dependiendo del tipo de microtomo que vayamos a usar es necesario colocar nuestro bloque de parafina solidificada en soportes especiales que se adapten a la pieza del microtomo que sostendrá el bloque de parafina.
Productos
Etanol de 70º, 80º, 90º, 96º y 100º
Xileno
Parafina
Material
Vasos de precipitado
Pinzas
Estufa a 60ºC
Molde para hacer bloques de parafina
Casetes de inclusión
