En histología y organografía es necesario observar estructuras tisulares en su contexto tridimensional para obtener una información que es difícil obtener a partir de secciones. Por ejemplo, la morfología de una red capilar, el patrón de ramificación de un axón de una neurona, la organización de la nefronas en un riñón o la expresión de un gen durante el desarrollo embrionario. La observación microscópica de muestras grandes se enfrenta a varios problemas. La calidad de la observación histológica con microscopios ópticos está limitada en gran manera por la pobre penetración de la luz a través de los tejidos, lo que hace que éstos sean en su mayoría opacos, o al menos translúcidos. Además, los tejidos están compuestos por diversas estructuras y moléculas que tienen diferente índice de refracción, es decir, que tienen propiedades ópticas diferentes. Cuando la luz tiene que atravesar estructuras con diferentes índices de refracción se produce dispersión de la luz. Por último, en los tejidos hay sustancias que absorben la luz como son los grupos hemo, la melanina y otros pigmentos.
Hay dos maneras de reducir los problemas de absorción y dispersión de la luz por las muestras biológicas, sobre todo cuando queremos estudiar detalles a nivel celular: hacer secciones histológicas de poco grosor o cambiar las propiedades ópticas de los tejidos mediante su aclarado.
Las secciones histológicas proporcionan una información bidimensional de una estructura que es tridimensional. Hay una regla en histología que nos dice que cuanto a más aumentos queremos observar una preparación, más delgada ha de ser la sección. La nitidez aumenta en las secciones delgadas porque la luz ha de atravesar menor cantidad de tejido. Así, hay aparatos para hacer cortes gruesos (>30-50 µm), cortes finos (2 - 10 µm) y semifinos (<1 µm). Actualmente existen las técnicas y programas informáticos que son capaces de reconstruir estructuras tridimensionales a partir de secciones. Este proceso es tedioso y consume mucho tiempo, pero se ha aplicado con éxito en diversos estudios. Sin embargo, se necesita una infraestructura cara y compleja que impide su adopción por laboratorios no especializados. También se pueden observar muestras relativamente gruesas con los microscopios multifotón, los cuales pueden conseguir imágenes nítidas a cientos de micras de profundidad. Aún así, a veces es necesario estudiar tridimensionalmente muestras más gruesas.
El aclarado de los tejidos es un procedimiento para cambiar las propiedades ópticas del tejido que nos permite observar nítidamente estructuras en zonas profundas de muestras gruesas. Su principal efecto es reducir la dispersión y la absorción de la luz por el tejido. En general el proceso consiste en eliminar lípidos, pigmentos y otras sustancias que dificulten el paso de la luz, y sustituir el agua por un medio con un índice de refracción homogéneo en toda la muestra, de modo que haya menos dispersión luminosa. Con técnicas de aclarado es posible observar estructuras tisulares en muestras muy gruesas. Estas técnicas se usan cuando se necesitan observar muestras de varios mm o incluso cm de grosor.
El proceso general que ha de seguir el tejido es fijación, permeabilización, decoloración de estructuras pigmentadas, homogeneizar el índice de refracción. La fijación es esencial y debe ser más fuerte puesto que el tejido será sometido a un estrés químico mayor. Se pueden usar los fijadores paraformaldehído, glutaraldehído y derivados de la acrilamida. La permeabilización es necesaria para que penetren en la muestra las moléculas o sustancias con las que queremos tratar la muestra, por ejemplo anticuerpos, y también para que difundan aquellas sustancias que homogeneizarán el índice de refracción. Permeabilizantes pueden ser solventes orgánicos, sustancias que eliminan los lípidos o sustancias hiperhidratadas. La decoloración se lleva a cabo con sustancias específicas según nuestro tejido. La homogeneización del índice de refracción es el último paso que conlleva el uso de solventes aromáticos, reactivos hidrofílicos o de contraste.
De todas formas es inevitable que cualquier tratamiento incluirá modificaciones, como retracciones o expansiones del tejido. Es interesante eliminar todo aquello que no necesitemos de la muestra para hacer la muestra lo más pequeña posible. Además, el aclarado debe eliminar la autofluorescencia en el caso de que necesitemos estudiar señales fluorescentes. Es interesante eliminar todo aquello que no necesitemos de la muestra para hacerla lo más pequeña posible y eliminar partes no necesarias.
Los protocolos de aclarado se pueden dividir según las sustancias que empleen: solventes orgánicos, hidro-gel y hidrofílicos. Dentro de estas categorías hay una gran variedad de protocolos, cada uno con sus ventajas e inconvenientes. Hay que seleccionar aquel que mejor se adapte a las necesidades del experimento.
Solventes orgánicos. Para usar esta técnica es necesaria una buena fijación, los aldehídos suelen ser buenos fijadores. Con los solventes orgánicos se alcanza una excelente transparencia. Una ventaja adicional es que, tras la observación, pueden ser eliminados y realizar otros protocolos sobre las muestras. Sin embargo, no hay protocolos de aclarado que sean universales y hay que adaptarlos para cada tipo de tejido. Tienen también inconvenientes. Así, pueden afectar a propiedades moleculares tales como la antigenicidad, eliminan la fluorescencia, y cambian la morfología celular etc. También pueden producir fuertes retracciones de los tejidos que afectan a la organización tridimensional de la muestra. Además, las sustancias usadas pueden dañar los objetivos del microscopio si no están adaptados.
Hidrogeles. Se utilizan en protocolos que tratan de evitar la pérdida de moléculas de los tejidos mediante la unión de estas moléculas a estructuras mixtas de gel y tejido. Estos geles suelen contener monómeros de acrilamida disueltos a 4ºC. La solución puede contener glutaraldehído y formaldehído, se puede decolorar, polimerizar la acrilamida y eliminar los lípidos.
Hidrofílicos. Son protocolos que usan sustancias disueltas en agua. Estas técnicas se pueden dividir en 2 grupos, aquellas que siguen una simple inmersión, y aquellas que requieren de eliminación de lípidos y/o una hidratación. En las inmersiones simples las muestras se sumergen en soluciones con un alto índice de refracción y se convierten en transparentes gradualmente. Sin embargo, los lípidos son la principal fuente de refracción de la luz, por lo que es interesante eliminarlos. Así, los métodos que incluyen eliminación de lípidos dan mejores resultados del aclarado.
Existen otros métodos para estudiar muestras de gran tamaño, incluso organismos completos, como son la tomografía computacional, la resonancia magnética, y la tomografía de emisión de positrones. Estas técnicas no son invasivas, incluso pueden hacerse con el individuo vivo, pero carecen de la resolución suficiente para hacer estudios a nivel de células individuales.
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Bibliografía ↷
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Bibliografía
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