Atlas de histología vegetal y animal

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Técnicas. Ampliaciones

ESTEREOLOGÍA

En biología, y en otras ciencias, es importante obtener datos cuantitativos, y que esos datos sean fiables. Los datos cuantitativos no sesgados son fundamentales en ciencia. La estereología es un conjunto de métodos experimentales que permiten estimar el área, el volumen, la superficie, la longitud y el número de elementos de estructuras biológicas tridimensionales mediante el estudio de secciones obtenidas de dichas estructuras. Por ejemplo, se puede estimar el número de neuronas del cerebro o de una región del cerebro, el volumen de un tumor, la superficie de los conductos respiratorios, o la longitud de la red capilar en un órgano.

La metodología estereológica se basa en un diseño a priori del procedimiento a emplear para realizar la cuantificación, sin hacer ninguna asunción sobre las características del objeto sobre el que se realizará dicha cuantificación. Es decir, se puede aplicar a cualquier objeto tridimensional sin necesidad de saber cómo es con antelación. De manera que el método es independiente del tamaño del objeto o de su forma. Si el diseño del experimento es correcto se obtienen datos no sesgados, lo que significa que no hay variaciones en el resultado introducidas por el experimentador o por el propio método. Es una metodología eficiente y con poco esfuerzo de muestreo se consiguen datos más precisos. El proceso de muestreo de la estructura es sistemático y aleatorio, es decir, todos los elementos de interés tendrán la misma probabilidad de ser contados.

Un concepto importante en estereología son las sondas ("probes"). Éstas son plantillas con formas geométricas virtuales que interaccionan con nuestros elementos de interés presentes en las secciones. Cada evento, o interacción de una forma geométrica con un elemento de interés, se transforma en un valor de número, longitud, área o volumen.

Volumen

Vamos a ver un ejemplo: estimación del volumen de un objeto.

Tradicionalmente el volumen de un objeto se ha estimado por inmersión en agua, y el volumen de agua desplazado es el volumen del objeto. Sin embargo, no sirve para objetos con cavidades internas o para objetos que están dentro de otros objetos. También se han estimado volúmenes por aproximación a una forma geométrica como una esfera, una elipse, un cuadrado, etcétera. De nuevo, el valor obtenido será cierto dependiendo de lo que se parezca el objeto a una forma geométrica determinada. El método empleado en estereología para estimar el volumen de cualquier objeto, independientemente de su forma, a partir de secciones, fue descrito por Cavallieri en 1635. Este método consiste en la obtención de secciones uniformes, paralelas, y aleatorias a lo largo del objeto. Se basa en la idea de que cualquier objeto puede estar representado por infinitas secciones consecutivas y no hay que hacer ninguna asunción previa, es decir, se puede aplicar a cualquier objeto tridimensional idependientemente de su forma o de si tiene oquedades.

Supongamos que queremos estimar el volumen de un órgano con superficie irregular como el que se aparece en la figura 1, y que tiene dos oquedades internas (no mostradas en la figura 1). Lo vamos a hacer a partir de secciones de parafina de unas 10 µm de grosor. Tenemos que tener en cuenta que las técnicas usadas, por ejemplo, la inclusión en parafina, pueden introducir retracciones en los tejidos que disminuyan el volumen real del órgano. Esto es muy importante a la hora de dar el resultado final. Supongamos que no hay retracción introducida por la técnica.

Figura 1. Objeto al que se le estimará el volumen.

Lo primero que hay que hacer es conseguir es que nuestro plano, la orientación de nuestras secciones, sea al azar, por lo que rotaremos nuestro objeto de forma aleatoria antes de hacer el primer corte. Una vez establecida la orientación del plano de corte podemos establecer el eje del objeto perpendicular a nuestro plano de corte. Dividimos la longitud del objeto a lo largo de dicho eje en 8 segmentos de igual longitud que vamos a llamar intervalos (T) (Figura 2).

Figura 2. Eje de corte y establecimiento de los intervalos.

A continuación, en el intervalo T1, elegimos un número al azar. Por ejemplo, si T1 mide 100 micras, un número aleatorio entre 1 y 100, y cortamos con una cuchilla por ese punto perpendicularmente al eje. Si hemos cortado completamente el objeto en secciones de parafina pues elegimos una de las secciones que componen el intervalo T1 al azar. Por ejemplo, si T1 está formado por 10 secciones, nos ha salido como aleatoria, entre la 1 y la 10, la sección número 6 (Figura 3). El intervalo T1 sería el número de secciones, 10, por el grosor de cada sección, por ejemplo 8 micrómetros. Por tanto, T1 valdría 80 micrómetros.

Figura 3. Selección de una sección al azar en el intervalo T1.

Una vez elegida la primera sección al azar seleccionamos la segunda sección que se encuentra a una distancia T (la del intervalo) de la sección primera, y luego una tercera que se encuentra a una distancia 2*T de la primera, y así sucesivamente (Figura 4 y 5). Si lo que hemos hecho es un plano de corte, pongamos a 60 micrómetros de los 100 que componen T1, el siguiente plano de corte lo haríamos a 100 micrómetros de distancia del plano primero (160 micrómetros), el segundo a 260 micrómetros y así sucesivamente. T, el intervalo, es constante en cada caso.

Figura 4. Secciones seleccionadas a partir de la primera selección al azar en T1 (ver Figura 3) y separadas por el intervalo T.
Figura 5. Perfiles de las secciones ya cortadas. Los espacios blancos son huecos.

Ahora tenemos que calcular la superficie de cada sección y multiplicar ese valor por el intervalo T. Para calcular una superficie se puede usar el método de recuento de puntos. Este método consiste en usar una rejilla virtual con puntos, en la que cada punto lleva asociado la misma área (Figura 6). Dicha rejilla se superpone rotada al azar sobre el perfil de cada sección y se cuenta el número de puntos que se solapan con la superficie de la sección. La densidad de la rejilla se adapta para que se cuenten unos 100 a 200 puntos totales, es decir, cuando se estudian todas las secciones.

Figura 6. Superposición entre la plantilla virtual de puntos (un punto es la intersección de los dos brazos de cada cruz. ) y la sección 56 (Figura 5). La plantilla se ha girado al azar y se cuentan los puntos que se solapan con nuestra estructura. Nótese que nuestro objeto esta hueco y que dicho espacio vacío no se cuenta. Cada punto lleva un área asociada que depende de nuestra plantilla, y que debe ser un valor real en nuestra sección. Así que hay que tener cuidado con los objetivos usados y los aumentos del microscopio.

El área de una sección sería el sumatorio de todos los puntos (p) que se solapan con la sección multiplicado por el área asociada a cada punto (a(p)). En el ejemplo de la figura 6 sería Área56=13p*a(p).

Para cualquier sección: Ai=∑p*a(p)

Ai = área de la sección i; n = número de puntos que se cuentan; a(p) = área asociada a cada punto.

El volumen de nuestro objeto que hay entre las dos primeras secciones consecutivas (secciones 6 y 16) sería el área de la sección 6 multiplicada por el intervalo T1.

V1=A6*T1

V1 = volumen entre la sección 6 y 16; A6 = área de la sección 6; T1 = intervalo entre las secciones 6 y 16.

El volumen total estimado de nuestro objeto o volumen de referencia (Vref) sería la suma de los volúmes que hay entre cada par de secciones, multiplicado por T. Vref=A6*T1 + A16*T2 + A26*T3 + ... Como todos los intervalos son iguales:

Vref=∑At*T

Vref = volumen de referencia o volumen estimado de nuesto objeto; ∑At = sumatorio de todas las áreas de nuestras secciones; T = intervalo entre secciones.

Bibliografía

Mouton PR. (2002). Principles and practice of unbiased stereology. An introuduction for bioscentists. The John Hopkins University Press. London.

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Actualizado: 02-06-2021. 10:17