Atlas de histología vegetal y animal

Un artefacto se define como cualquier alteración indeseada introducida en una muestra de tejido debido a las técnicas de procesamiento que se realizan para su observación. Pueden ser espacios sin tejido, roturas, pliegues, colores anormales, precipitados, burbujas de aire, etcétera. En algunas ocasiones son inevitables, pero en la mayoría de los casos son consecuencia de un mal procesamiento histológico. Reconocer estas alteraciones es esencial para una buena interpretación y diagnosis de la muestra, especialmente si tratamos con muestras patológicas.

Los artefactos se pueden introducir en cualquier paso del proceso histológico, desde la toma de la muestra hasta el montaje para su observación. Vamos a describir los artefactos cronológicamente según el momento de la técnica histológica donde pueden ser introducidos: obtención de la muestra, fijación, inclusión, corte, tinción y montaje.

1. Obtención de la muestra

Numerosos artefactos observados con el microscopio son consecuencia de un proceso de necropsia, es decir, ha transcurrido un tiempo excesivo entre el cese del flujo sanguíneo y la fijación del tejido. Por ejemplo, 3 minutos postmortem son suficientes para producir expansiones de las vellosidades intestinales. Además, se pierde nitidez en los límites de las membranas y descamación en epitelios, sobre todo prismáticos o columnares. Por tanto, hay que procurar que la fijación siga inmediatamente a la extracción del tejido, y que el tamaño de la pieza no sea muy grande. En el caso de muestras grandes o animales pequeños, es recomendable la fijación por perfusión. A nivel celular, los núcleos parecen haber perdido cromatina y tienen un halo azul. Algunos núcleos aparecen picnóticos, consecuencia del comienzo de la autolisis. También hay retracciones, espacios vacíos y disrupción del citoplasma. El retraso en la fijación puede ser porque el tejido no ha entrado en contacto con el fijador, por ejemplo en piezas grandes (un truco es abrir los órganos huecos como el útero, o el digestivo). También que el volumen de fijador respecto a la muestra no sea mayor de 1:20. La solución es fijar lo antes posible, hacer piezas pequeñas y abrir órganos huecos. Los pulmones se pueden fijar por perfusión por gravedad. También ayuda a incrementar la velocidad de fijación la agitación de las muestras.

Durante la obtención de las muestras de tejidos es recomendable evitar deformarla y/o perforarlas durante su manipulación, puesto que estas alteraciones no pueden ser corregidas durante la fijación (Figura 1). En la extracción de biopsias hay que tener en cuenta a qué tratamiento se ha sometido previamente a la muestra. Así, podemos encontrar restos de sutura, colorantes que han delimitado la región, polvos de talco de los guantes, demasiado anestésico, métodos de obtención que emplean calor, etcétera. Todo ello puede introducir alteraciones que tendrán que ser tenidas en cuenta.

En algunos casos hay que tener en cuenta la diferente dureza entre partes de la muestra que se quiere obtener. Se pueden producir roturas o espacios sin tejido entre las partes duras y las blandas durante la extracción. Por ejemplo, en las muestras de retina la dureza de la esclerótica facilita que se desprendan los segmentos externos de los fotorreceptores del epitelio pigmentario (algo similar a lo que se produce en los desprendimientos de retina), creando un espacio artefactual.

2. Fijación

Durante la fijación se pueden producir diversas alteraciones del tejido consecuencia de una mala elección del fijador, de la formación de pigmentos de hemateína o de formalina ácida, de la adherencia de las muestras al recipiente de fijación, de una cantidad de fijador o tiempo de fijación inadecuados, muestras muy grandes, etcétera. En un tejido bien fijado los núcleos deben presentar una variedad de patrones de tinción que se corresponden con la distribución de la heterocromatina, no debe haber espacios entre células, el citoplasma se debe teñir bien con la eosina, no debe haber retracciones celulares.

En la fijación por inmersión se recomiendan piezas no superiores a 6 mm, siendo el volumen de fijador unas 20 veces el volumen de la muestra. En histopatología, el fijador usado normalmente es la formalina al 10%. La fijación por inmersión debe durar al menos de 8 a 12 h, aunque se sugiere de 48 a 1 semana de fijación. Una fijación muy prolongada dificulta la obtención de secciones por endurecimiento del tejido, pero además puede producir retracciones del mismo. Es recomendable usar el fijador en soluciones amortiguadoras de pH e iso-osmóticas para evitar posibles retracciones o expansiones del tejido producidas por el uso de soluciones hipertónicas o hipotónicas, respectivamente. Un tiempo de fijación excesivo no sólo altera la consistencia del tejido sino también sus características bioquímicas y reactivas, siendo posible por tanto los falsos positivos y/o negativos. Se puede producir contaminación con herrumbre cuando el frasco usado para la fijación tiene componentes metálicos, como puede suceder con la tapa del frasco. Si la fijación es incompleta aparecen los núcleos difuminados, los componentes de los tejidos se pueden separar fácilmente de la sección durante el estiramiento en el baño de agua, la morfología tisular no se mantiene. Una fijación incompleta puede deberse a que las muestras estuvieron un tiempo insuficiente, volumen de fijador insuficiente (por encima de 1/20), mala penetración (3 mm máximo de grosor), solución de formol agotada (se podría cambiar la solución de fijador durante el proceso de fijación).

Por otro lado, la elección del fijador ha de considerar el medio de inclusión, el método de corte y la técnica de tinción. Por ejemplo, hay fijadores que no son apropiados para inclusiones en parafina, como es una elevada concentración de glutaraldehído, tetróxido de osmio, acroleína y otros. Sin embargo, estos mismos fijadores sí son apropiados para inclusiones en resinas.

3. Deshidratación e inclusión

Si tras la fijación se ha de retallar la muestra para su inclusión hay que evitar que queden restos de tejido no deseado en la muestra a incluir. Las muestras con partes que pueden desprenderse han de procesarse por separado para evitar que un bloque contenga tejidos de muestras diferentes.

La inclusión en parafina siempre tiene un paso previo de deshidratación, puesto que la parafina no es hidrosoluble. Esto paso implica sustituir el agua de la muestra por alcohol, éste por la sustancia aclarante (normalmente xileno) y ésta última por la parafina. Si el agua permanece en el tejido, la parafina no penetrará y la inclusión será defectuosa (Figura 2). Los alcoholes pierden gradación por la incorporación de agua de la atmósfera y de las propias muestras. Por ello, siempre que sea posible, se han de usar alcoholes recién preparados o con pocos usos. En caso de encontrarnos defectos que supongamos consecuencia de una mala deshidratación, las muestras pueden volver a la estufa para licuar la parafina, aclarante, e hidratarse de nuevo, y así hacer una nueva inclusión.

Si la deshidratación no es adecuada pueden formarse cristales del fijador que permanecen en el tejido. Además, la presencia de restos de agua en la muestra acarrea problemas de corte, provoca a una mala tinción de esa zona y resulta en una mayor opacidad del tejido. Pero si la deshidratación es excesiva en el tiempo, los tejidos se pueden volver frágiles y duros, lo que puede interferir con el proceso de corte y con los colorantes. Problemas por exceso de deshidratación: aparecen las secciones como persianas causadas por la cuchilla en el borde de la muestra y roturas en las células tipo persiana.

Es muy importante que las muestras no se sequen durante la deshidratación, especialmente en el paso de la sustancia de aclarado. De lo contrario, se pueden crear y retener burbujas de aire en la muestra que luego aparecerán como zonas comprimidas de tejido rodeando a espacios vacíos. Si el tiempo en el líquido aclarante ha sido largo, se producen retracciones del tejido.

Si la inclusión en parafina no fue buena, las secciones se estirarán muy rápidamente cuando se colocan en el baño con agua caliente, lo que puede provocar que las estructuras tisulares se separen unas de otras, como ocurre con epitelios, cartílagos, etcétera. También pueden aparecer grietas. La mala infiltración de la parafina puede estar causada por una mala fijación, deshidratación, aclarado o tiempo insuficiente en la propia infiltración.

Trazas de los líquidos de deshidratación y aclarado en la muestra incluida pueden llevar a secciones con arrugas, que no se estirarán durante el estiramiento con calor, ni cuando se monten en el portaobjetos. Además, esta porción del tejido se teñirá más intensamente puesto que los colorantes tienen acceso al tejido por las dos superficies, y pueden quedar retenidos en el pliegue.

Si el medio de inclusión es más duro que la muestra se producen arrugas y grietas. Hay que tener especial cuidado cuando se manipulan las muestras con pinzas calientes durante el proceso de inclusión, estos instrumentos no deben estar sobrecalentados.

4. Corte

Una mala sujeción de la cuchilla o de cualquier otra pieza del microtomo puede llevar a secciones con diferente grosor en diferentes partes de la muestra, o incluso a la pérdida de la muestra. También cuando el ángulo de inclinación de la cuchilla no es adecuado o la cuchilla no está bien afilada. El ángulo de inclinación posible de la cuchilla en los microtomos modernos puede oscilar entre 10 y 15 grados. Si el ángulo es muy agudo la cuchilla comprime el tejido, normalmente donde el tejido es más blando. Igual compresión y arrastre del tejido ocurre en cuchillas mal afiladas.

Cuando se selecciona un grosor de corte muy delgado las secciones pueden salir arrugadas y a veces no es posible estirarlas en el agua. Se pueden producir secciones incompletas por una mala inclusión o porque se ha elegido un grosor de corte muy delgado. Si la cuchilla está mellada se producen roturas estriadas en las secciones (Figura 3). Conviene que la muestra esté completamente rodeada por medio de inclusión para que la cuchilla no “ataque” directamente a la muestra, lo cual podría deformarla o dañarla.

5. Estiramiento de los cortes

El agua que se emplea para estirar los cortes debe ser destilada, para que al evaporarse no queden cristales, y limpia para que no haya restos extraños. Además, durante el secado de los cortes, deben protegerse del polvo y partículas.

Cuando la temperatura del agua es muy alta o muy baja pueden generarse grietas en las secciones. Si está muy alta se producen expansiones del tejido y pueden aparecer núcleos picnóticos y burbujas nucleares. También hay que tener en cuenta la distribución de las secciones para evitar que se solapen o se arruguen por falta de espacio durante el estiramiento (Figura 4).

Hay que evitar que durante el montaje queden burbujas entre los cortes y el portaobjetos, porque esto provoca roturas o distensiones del tejido, malas tinciones y poca adherencia del corte al cristal.

Los portaobjetos tienen que estar completamente limpios y sin restos de ningún tipo. Si los portaobjetos se han cubierto con el adherente en el propio laboratorio (son muy comunes los portaobjetos recubiertos con gelatina y alumbre de cromo y potasio), se ha de tener especial cuidado en que no se produzcan grumos de la solución sobre el portaobjetos cuando se está secando en la estufa. Además, la solución debe ser transparente y, una vez sumergidos los portaobjetos, deben escurrirse muy bien. Por otra parte, si la calidad del adherente usado no es buena, los cortes podrían desprenderse total o parcialmente del portaobjetos durante el procesado posterior.

6. Tinción

La eliminación de la parafina debe ser completa antes de la tinción porque los restos de parafina producen mala penetración de los colorantes, alterando la calidad de la tinción.

Las soluciones de colorantes han de estar limpias de microorganismos y filtradas para evitar artefactos como cristales o precipitados de colorante (Figura 5). Es una buena práctica filtrar la solución del colorante antes de su uso.

Cuando se tiñen las muestras añadiendo gotas de colorante sobre las secciones, no sumergiendo el portaobjetos en la solución, hay que procurar que todo el corte quede cubierto y que no se seque la solución durante el tiempo de tinción para que la coloración sea homogénea y así evitar precipitados de colorante por evaporación local.

Los artefactos más frecuentes producidos durante la tinción suelen deberse a un aclarado incompleto del colorante y a la precipitación de cristales de colorante en el tejido. En algunos casos es necesario adaptar el tiempo de tinción a las características de la muestra (grosor, dureza, etc.), para que el tejido se tiña adecuadamente.

7. Montaje

Una vez teñidas las secciones, la deshidratación ha de ser completa para evitar la aparición de gotitas de agua en el medio de montaje (Figura 6). Si esto ocurre, se puede solucionar sumergiendo otra vez las secciones en el aclarante, alcohol absoluto y en alcoholes de gradación decreciente, hasta su hidratación, y repitiendo la deshidratación en mejores condiciones (soluciones nuevas, alargar tiempos, etc.). Sin embargo, en algunos casos el tiempo en alcohol determina el grado de tinción, por los que habría que volver a pasar de nuevo por las soluciones de colorantes.

El cubreobjetos tiene que estar limpio y hay que manipularlo cogiéndolo por los bordes. Además, no deben quedar burbujas de aire durante el montaje y hay que tener cuidado con la cantidad de medio de montaje a utilizar: si es poco podría no cubrir toda la sección cuando se evapore el aclarante. Si se añade un exceso de medio de montaje se generará una capa tan gruesa que no se podrán utilizar objetivos de gran aumento, como el de 100x. Estos objetivos tienen una distancia focal muy corta, es decir, la lentes de estos objetivos deben estar muy próximas a la muestra para poder enfocarla. y el aumento del espesor normal del medio de montaje se lo impedirá. Del mismo modo, debe usarse un medio de montaje lo más parecido a cómo se obtuvo de la casa comercial puesto que con el tiempo los medios de montaje suelen perder el disolvente y se vuelven más viscosos. Esto hace que sea más difícil conseguir una capa delgada y por tanto estamos en el mismo problema mencionado anteriormente.

El corte no se debe secar una vez que sale del aclarante y antes de añadir el medio de montaje puesto que se pueden generar burbujas (Figura 7). Si, tanto el portaobjetos como el cubreobjetos, se ensucian por sus caras exteriores durante este proceso por un exceso de medio de montaje (lo cual dificultaría la visualización de la muestra en el microscopio), éste se puede eliminar lavando cuidadosamente la preparación con aclarante o limpiándolo con una cuchilla afilada.

8. Consejo general

Antes de realizar cualquier técnica histológica se deben hacer pruebas con diferentes tiempos de fijación, deshidratación, inclusión y tinción. Aunque hay establecidos unos tiempos estándar para cada uno de estos procesos hay que considerarlos orientativos porque cada tejido reacciona de diferente manera ante los distintos procedimientos histológicos.

• Bibliografía ↷

  • Jimson S. Malathi L, Kumar GMK, Balachander N. 2016. Artefacts in histologycal section. Biomedical and pharmocology journal. 9: 843-845.

    McInnes E. 2005. Artefacts in histopathology. Comparative clinical pathology. 13: 100-108.