El microscopio óptico es un elemento esencial para los estudios generales de histología puesto que es el que nos permite observar las diferentes características morfológicas de las células y los tejidos. Se basa en el uso de lentes para aumentar los rayos de luz que atraviesan una muestra de tejido. Su invención se remonta al siglo XVII. Desde entonces se ha ido perfeccionando hasta llegar a los modernos microscopios. Durante estos siglos, el mayor avance en cuanto a perfección y calidad se ha producido en su principal elemento, las lentes, las cuales aumentan la imagen de las secciones de tejido y permiten hacer visibles al ojo humano detalles nítidos que de otra manera sería imposible observar.
Los microscopios ópticos tienen un límite máximo de resolución de 0,2 µm. El poder de resolución es la distancia mínima a la que se pueden discriminar dos puntos. Este límite viene determinado por la longitud de onda de la fuente de iluminación, en este caso la luz visible.
Contiene normalmente dos sistemas de lentes: el objetivo y el ocular. El objetivo recoge la luz que atraviesa la sección de tejido, mientras que el ocular es el que proyecta la imagen sobre la retina. El aumento total que permite un microscopio óptico se calcula multiplicando la magnificación que produce el objetivo por la que produce el ocular. Por ejemplo, si estamos usando un objetivo de 40x (aumenta 40 veces) y un ocular de 10x (aumenta 10 veces), el resultado final sera de 400x, es decir, vemos la muestra aumentada 400 veces. Usando microscopios ópticos avanzados se consiguen unos 1000-1500 aumentos (objetivo de 100x junto con oculares de 10x o 15x). Algunos microscopios ópticos tienen lentes internas que producen aumentos adicionales que tendremos que tener en cuenta para calcular la magnificación de la imagen que se observa. No debemos confundir los aumentos con el poder de resolución. Por más que consigamos aumentar una imagen tomada de un microscopio, incluso con metodología digital, no se puede aumentar la resolución de la imagen.
1. Partes del microscopio
Un microscopio óptico compuesto está formado por las siguientes partes:
Oculares. Son las lentes que forman la imagen que observaremos con nuestros ojos (Figura 1). Todos los microscopios actuales poseen dos oculares, uno para cada ojo. Por eso a los microscopios actuales se les llama binoculares. Los primeros microscopios eran monoculares, es decir, poseían un solo ocular. Hay que tener en cuenta que en los microscopios más avanzados tanto el objetivo como el ocular suelen estar compuestos por varias lentes. Al menos uno de los oculares puede regularse para alejar o acercar la lente al objetivo, permitiendo ajustar el enfoque a las condiciones de visión, dioptrías, de cada observador. Los dos oculares también se pueden acercar o separar para ajustar su separación a la separación de los ojos del observador.
Objetivos. Los objetivos son las lentes que reciben la luz directamente tras atravesar la sección histológica y quizá sean los elementos más importantes del microscopio. Hoy en día los microscopios ópticos poseen un tambor o revólver donde se encuentran varios objetivos. Cada uno de ellos posee lentes que permiten diferentes aumentos. Las magnificaciones de los objetivos más usados suelen ser de 4x, 10x, 20x, 40x y 100x. Rotando el revólver se puede seleccionar el objetivo y por tanto el aumento al que queremos observar la preparación. Aparte de los aumentos, los objetivos tienen una serie de características para mejorar la imagen. Así, pueden ser acromáticos, de fluorita o apocromáticos, los cuales corrigen alteraciones cromáticas, de campo plano que eliminan la curvatura del campo de observación, de contraste de interferencia, etcétera.
Cuando se usan objetivos de 100 aumentos (100x) es necesario emplear un líquido denominado aceite de inmersión, que se añade entre el objetivo y la muestra. Esto es debido a que la refracción de la luz es alta en el aire y provoca alteraciones en la imagen que se manifiestan cuando se usan objetivos con esta capacidad de aumento. El aceite de inmersión reduce enormemente esta refracción permitiendo imágenes mucho más nítidas (Figura 2).
Platina. Es la plataforma donde se coloca el portaobjetos con nuestro tejido. Posee un dispositivo para sujetar el portaobjetos, el cual se puede desplazar en el plano de la platina, movimiento controlado manualmente.
Condensador. Es un dispositivo con una lente que concentra y focaliza la luz proveniente de la fuente sobre la sección de tejido.
Diafragma. Se sitúa entre la fuente luminosa y el condensador. Permite aumentar el contraste de la muestra y la profundidad de campo, es decir, el espesor de la muestra que está enfocado.
Lámpara luminosa. Es la que proporciona la luz que atraviesa la sección de tejido. Inicialmente se usaba la luz natural, la cual se podía concentrar en la sección de tejido mediante espejos cóncavos. Actualmente se usa una lámpara cuyo haz de luz atraviesa el diafragma, el condensador, la muestra, y tras ello penetra por el objetivo y atraviesa los oculares hasta nuestros ojos (Figura 3). La intensidad de la fuente luminosa se puede regular mediante un reostato.
Macrométrico y micrométrico. El enfoque de la muestra se consigue variando la distancia de la muestra a la lente del objetivo. Esta distancia depende de los aumentos que produzca el objetivo, mayor distancia cuanto menores aumentos, y del tipo de objetivo. La distancia se controla mediante dos ruedas denominadas macrométrico y micrométrico, respectivamente. La primera permite movimientos ascendentes y descendentes amplios de la platina y la segunda ajustes finos.
2. Modificaciones
Contraste de fase. Esta modificación del microscopio de campo claro necesita de objetivos especiales y se basa en el ligero retraso que sufre la luz cuando pasa por las estructuras tisulares en función de su densidad. De esta manera se consiguen diferentes luminosidades para distintas estructuras tisulares. Se emplea para ver muestras sin teñir o acuosas, así como células vivas, por ejemplo en cultivos celulares.
Campo oscuro. La observación en campo oscuro es un buen sustituto del contraste de fase para observar especímenes sin teñir o medios acuosos. Consiste en la incorporación de un objeto opaco bajo el condensador, entre la fuente luminosa y la sección de tejido. Este objeto sólo deja pasar la luz más lateral que incidirá sobre la muestra de forma oblicua y sólo aquella luz que sea reflejada por la muestra llegará a los objetivos. Allí donde no haya tejido aparecerá oscuro y distintas densidades o propiedades del tejido reflejarán diferente cantidad de luz.
Contraste de interferencia y Nomarski. Este tipo de microscopía aparece sólo en los microscopios más avanzados y supone tener objetivos especiales. Estos métodos dan a los tejidos un aspecto tridimensional, es decir, aumentan la profundidad de campo (espesor de tejido que está simultáneamente enfocado). Se basa en el uso de filtros que polarizan la luz, lo cual consiste en dejar pasar sólo a la ondas electromagnéticas que vibran en un determinado plano. Posteriormente pasan por un prisma que reagrupa esta luz en elementos separados por una distancia que es similar al poder de resolución del objetivo que se está usando. Existe un prisma para cada objetivo. Entonces la luz pasa por el muestra y las diferencias de densidad del tejido, como los bordes de las células o densidades del interior celular o matriz extracelular, provocarán alteraciones en la luz que se dirige hacia los objetivos, los cuales transformarán esas diferencias en cambios en la luminosidad. Todavía existe otro filtro adicional entre el objetivo y los oculares que permiten modular la luminosidad aún más.
3. Variantes
Estereomicroscopio. También se llama microscopio de disección, lupa binocular o simplemente lupa. Se utiliza normalmente para manipular muestras pequeñas o para observar características que no requieren grandes aumentos, entre 7 y 40 de aumentos, aunque pueden llegar hasta 100. Pueden observarse las muestras con diferentes aumentos, lo que se consigue mediante un sistema de movimientos de lentes o intercambiando objetivos. Al ser binoculares se observan los objetos en tres dimensiones y tienen una gran distancia focal, es decir, las muestras se sitúan lejos de los objetivos, con lo que la manipulación es más fácil. La iluminación de la muestra puede venir de diferentes fuentes, que pueden ser externas.
4. Fluorescencia
El microscopio de fluorescencia se usa para observar sustancias fluorescentes denominadas fluoróforos. Una molécula fluorescente es aquella que es capaz de captar radiación electromagnética con una longitud de onda determinada y emitir otra radiación electromagnética con otra longitud de onda diferente, normalmente dentro del espectro de la luz visible. Los fluoróforos se utilizan como marcadores para la detección de otras moléculas tisulares, normalmente mediante la técnica de inmunofluorescencia. Los usados en microscopía absorben en el rango de la luz ultravioleta, normalmente producida por una lámpara de mercurio, y emiten en el rango de la luz visible. Para seleccionar el rango de longitud de onda con que serán iluminados se utilizan filtros específicos localizados entre la fuente y la muestra que sólo dejan pasar un determinado rango de frecuencias. Con un tambor de filtros se consigue iluminar la muestra con diferentes rangos de ondas electromagnéticas y por tanto activar selectivamente a diferentes fluoróforos.
La microscopía de fluorescencia nos permite usar más de un fluoróforo para detectar varias moléculas tisulares de forma simultánea siempre que los espectros de absorción y emisión de estos fluoróforos no se solapen (Figura 4), puesto que entonces sería imposible discriminarlos.
Una aplicación más avanzada de la fluorescencia se da en los microscopios confocales, los cuales permiten eliminar la luz difusa procedente de fluoróforos que están en el tejido fuera del plano de enfoque. Esta luz difusa, que aparece en los microscopios de fluorescencia convencionales, provoca una difuminación y pérdida de nitidez de la imagen. Por tanto, con el microscopio confocal se consiguen imágenes mucho más nítidas y mediante la digitalización y solapamiento de planos de foco sucesivos se pueden conseguir imágenes tridimensionales.
Observación
