La hematoxilina es un colorante natural que se obtiene de la madera del árbol Haematoxylum campechianum. El nombre deriva del griego: haimatos: sangre y xylon: madera. La hematoxilina que se compra proviene directamente de estos árboles que son originarios de América Central y del Sur. Aunque se ha conseguido sintetizar en el laboratorio, su producción sigue siendo natural. Para su obtención se astilla la madera y se hierve. Se obtiene una solución rojiza que luego se vuelve amarilla, y posteriormente negruzca cuando se vuelve a enfriar. El agua se evapora dejando la hematoxilina cruda con una pureza que puede llegar al 10 %. Es necesario purificar posteriormente con éter, secar y volver a cristalizar en ambiente acuoso.
Como colorante fue introducido independientemente por Böhmer (1865), quien la usó con el añadido de un mordiente, y Fischer (1875). Wossowzky (1876) introdujo la mezcla hematoxilina y eosina en un mismo protocolo de tinción.
El colorante no es realmente la hematoxilina sino la hemateína, la cual se consigue durante la preparación del colorante mediante la oxidación química de la hematoxilina (Figura 1), aunque también se puede obtener por oxidación del oxígeno atmosférico dejándola madurar durante 6 a 8 semanas. El yodato sódico es el agente oxidante más comúnmente usado (0.2 g oxidarán a 1 g de hematoxilina). Otros son la iodina, el peróxido de hidrógeno, óxido de mercurio o el permanganato potásico. Esta oxidación continuará por la acción atmosférica y si el colorante es muy viejo se puede producir una sobreoxidación que resultará en malas tinciones. Esta tasa de oxidación elevada se puede reducir añadiendo glicerol o un alcohol a la solución. Durante la preparación habitual del colorante se añade la mitad del oxidante necesario para oxidar toda la hematoxilina de la solución, por lo que con el tiempo se irá produciendo más hemateína sin riesgo de sobreoxidación, y el colorante se podrá usar durante mucho tiempo. La hemateína no se vende directamente en soluciones de heamateína porque es muy inestable.
Tras añadir yodato sódico, el oxidante más empleado, se puede hervir y acelerar la oxidación, tanto que se pueden usar en cuanto se enfríe a solución. La ebullición no es necesaria puesto que se puede conseguir el mismo resultado a temperatura ambiente durante unos pocos días.
La hemateína en solución tiene un color rojo a pH menor que 1, amarilla a un pH entre 1 y 5, y violeta a un pH por encima de 6. La hemateína no tiñe por sí sola, sino que necesita iones metálicos cargados negativamente, y que actúan como mordiente. Normalmente estas sales son de aluminio (como el alumbre de amonio o de potasio) o de hierro (cloruro férrico o alumbre de hierro). Las soluciones que contienen alumnio y hemateína se llama hemalumbre. Otros mordientes menos frecuentes son el alumbre de cromo, y sólo en casos especiales se añade iones de plomo, cobre, zirconio, ácido fosfotúngstico o ácido fosfomolíbdico. La cantidad de iones ha de ser mayor que la de hemateína y debe ser una solución acidificada. La hematoxilina con mordiente de aluminio se usa para resalta núcleos, los mordientes de hierro permiten teñir núcleos en ambientes ácidos y para resaltar las estrías musculares. Con ácido fosfotúngstico se usa para destacar las estrías musculares, fibrina y fibras gliales. El color de la tinción con hematoxilina se puede cambiar mediante su combinación con los mordientes. Así, cuando se mezcla con alumbre de aluminio se consigue un color azul, el alumbre de hierro da un color negro y las sales de estaño dan un color rojo. Las soluciones de hematoxilina de hierro no necesitan la adición de agentes oxidantes puesto que las sales de hierro funcionan tanto como mordiente como agente oxidante.
La tinción con hematoxilina puede ser progresiva o regresiva. Se prefiere normalmente una tinción progresiva, pero si se ha sobreteñído se puede corregir con alcohol de 70º o 95º, con un poco de ácido clorídrico. También se puede usar una solución acuosa acidificada, pero el proceso es más lento. La sobretinción se puede prevenir añadiendo a la solucion de colorante más aluminio o acidificándola más. El hemalumbre cambia de color marrón a azul a pH 6, esa es la razón por la que las secciones se ponen en agua del grifo tras el paso por la solución de tinción.
La hemateína-hierro da un color mucho más oscuro. En la hematoxilina de Heidenhain la hemateína y el hierro se aplican secuencialmente obteniendo una gran variedad de estructuras teñidas por diferenciación. Esta hematoxilina es recomendada cuando se aplican soluciones ácidas posteriores puesto que la tinción del núcleo es muy fuerte. Además, es una tinción progresiva.
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Bibliografía ↷
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Kiernan JA. 2008. Histological and histochemical methods. Theory and Practice. Scio Publixhing limited 4th Edition. Oxfordshire.UK. ISBN: 9781904842422
Llewellyn BD. 2013. Hematoxylin formulae. Stain files. http://www.stainfile.info.
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