Atlas de histología vegetal y animal

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Técnicas. Protocolos

AZÁN de HEIDENHAIN

Este método es una modificación de la tinción tricrómica de Mallory. Su ventaja es que diferencia una mayor diversidad de estructuras histológicas, sobre todo por la obtención de imágenes nucleares con diferente coloración. El protocolo debe adaptarse a cada tipo de material, siendo necesarios ensayos previos.

Procedimiento

Partimos de muestras que han sido fijadas e incluidas en parafina. Estas muestras se han cortado en secciones de unas 8 µm y adheridas a portaobjetos recubiertos con gelatina. Cuando los cortes provienen de material que ha sido fijado con un fijador que contiene ácido pícrico hay que eliminarlo mediante permanencia en alcohol con anilina (1% de anilina en etanol de 96º) durante 30 minutos.

1.- Xileno para desparafinar, 2x10 min.

2.- Etanol 100º, 2x10 min.

3.- Etanol 96º, 10 min.

4.- Etanol 80º, 10 min.

5.- Etanol 50º, 10 min.

6.- H2O destilada, 5 min.

7.- Azocarmín previamente calentado a 60 ºC durante, 1 h a 60ºC

Azocarmín G
0.1 g de azocarmín G (C.I. 50085)
200 ml H2O destilada
2 ml de ácido acético

8.- H2O destilada, varios lavados.

9.- Diferenciar bajo el microscopio mediante inmersiones sucesivas en alcohol-anilina (anilina al 0.1 % en etanol 96º).
La velocidad de diferenciación es proporcional a la cantidad de anilina y a la concentración del alcohol. Según el resultado deseado, puede modificarse la composición de la mezcla alcohol-anilina, desde alcohol de 70º con un 1% de anilina, hasta el alcohol de 96º con un 0,1% de anilina.

10.- Detener la diferenciación con etanol-acético (ácido acético 1% en etanol 96º)

11.- H2O destilada, varios lavados.

12.- Ácido fosfotúngstico al 5%, 1 hora.
Este ácido actuará como mordiente y prepara la tinción con el azul de Heidenhain al mismo tiempo que continúa la diferenciando el azocarmín.

13.- H2O destilada, varios lavados.

14.- Azul de Heidenhain, 2 h.

Azul de Heidenhain
0.2 g de azul de anilina (C.I. 42755)
0.5 g de naranja G (C.I. 16230)
100 ml de H2O destilada
1 ml de ácido acético

15.- Etanol 96º, una inmersión rápida.

16.- Etanol 100º, varias inmersiones rápidas.

17.- Xileno, 2x10 min.

Resultados

Núcleos: distinta coloración, desde naranja a rojo
Citoplasma: coloración diversa
Músculo: naranja a rojo
Colágeno: azul

Consejos

Hay que modificar el protocolo según la muestra con el que se esté trabajando.

Son críticos los pasos de diferenciación.

La deshidratación final ha de ser muy rápida para no perder la coloración azul.

Productos

Xileno

Etanol de 50º, 80º, 90º, 96º y 100º

Azocarmín G (C.I. 50085)

Anilina

Azul de anilina (C.I. 42755)

Naranja G (C.I. 16230)

Ácido fosfotúngstico

Ácido acético

H2O destilada

Agua corriente

Medio de montaje

Material

Cubetas de tinción

Estufa a 60 ºC

Cesta para portas

Cubreobjetos

Hematoxilina eosina azul alcián Hematoxilina eosina azul alcián
Secciones de piel (arriba) y pulmón (abajo) teñidas con azán de Heidenhain. En la imagen de pulmón se puede observar como hay núcleos teñidos con diferente coloración, desde rojo oscuro a gris pálido, pasando por el naranja.
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Actualizado: 29-07-2019. 13:27