Así como para observar tejidos animales es imprescindible usar colorantes que diferencien el núcleo del citoplasma, en el caso de los tejidos y órganos vegetales se usan colorantes con afinidad por las paredes celulares. La tinción vegetal por excelencia se caracteriza por usar la safranina, que presenta afinidad por las paredes lignificadas (paredes secundarias), y un segundo colorante que puede ser el azul alcián o el verde rápido, ambos con afinidad por las paredes no lignificadas (paredes primarias). La safranina O de Johansen combinada con el verde rápido es una buena técnica para teñir tejidos vegetales y diferenciar entre paredes celulares primarias y secundarias.
Procedimiento
Partimos de muestras fijadas con FAA (formaldehído, alcohol, acético) e incluidas en parafina. Los cortes tendrán un grosor de 5 a 10 μm. También podemos teñir cortes gruesos obtenidos con vibratomo o microtomo de congelación, pero entonces hay que ajustar los tiempos.
1.- 2x10 min en xileno para desparafinar
2.- 2x10 min en etanol 100º
3.- 10 min en etanol 96º
4.- 10 min en etanol 80º
5.- 10 min en etanol 50º
6.- 5 min en H2O destilada
7.- 24 h en safranina O de Johansen.
Safranina O de Johansen
2-metoxietanol (Etilen glicol monometil éter): 50 ml
Etanol 100º: 25 ml
H2O destilada: 25 ml
Acetato sódico: 1 g
Disolver
Formaldehído 37 % (formalina): 2 ml
Safranina O (C.I. 50240): 1 g
8.- 2 x 5 min en H2O destilada.
9.- 10 s en etanol 96º + 0.5 % de ácido pícrico o de ácido clorhídrico en agitación suave.
10.- 10 s en etanol 96º + 4 gotas de hidróxido amónico en agitación suave.
11.- 10 s en etanol 100º en agitación suave.
La tinción con safranina es regresiva, luego la intensidad de color rojo se controla con los tiempos en los tres pasos anteriores. Si son demasiado largos la coloración se puede perder por completo.
12.- 20 s en verde rápido con agitación suave.
Verde rápido
2-metoxietanol (Etilen glicol monometil éter): 33.3 ml
Etanol 100º: 33.3 ml
Metil salicilato: 33.3 ml
Verde rápido FCF (C.I. 42053): 0.05 g
13.- 5 a 10 s en solución de aclarado diluida con agitación suave.
Solución de aclarado diluida
Solución de aclarado (ver más abajo): 50 ml
Etanol 100º: 25 ml
Xileno: 25 ml
14.- 10 s en solución de aclarado con agitación suave.
Solución de aclarado
Metil salicilato: 50 ml
Etanol 100º: 25 ml
Xileno: 25 ml
15.- 2x10 min xileno
16.- Montado en medio de montaje.
Consejos
El control de los tiempos en los pasos del protocolo tras los colorantes es fundamentales para una buena tinción.
La safranina es una tinción regresiva luego el grado de tinción se controla con el tiempo de lavado en los alcoholes posteriores, mientras que el grado de coloración con verde rápido se consigue variando el tiempo en el propio colorante.
Al ser conveniente una agitación suave en cada paso de aclarado, la tinción ha de hacerse individualmente a cada portaobjetos.
Productos
Xileno
Etanol de 50º, 70º, 90º y 100º
Acetato sódico
Ácido clohídrico
Safranina O (C.I. 50240)
Formol 37%
2-metoxietanol
Metil salicilato
Verde rápido FCF (C.I. 42053)
Solución saturada de ácido pícrico
Hidróxido amónico
H2O destilada
Medio de montaje
Material
Cubetas de tinción
Pinzas
Portaobjetos
Cubreobjetos
Botes para almacén de soluciones
