Atlas de histología vegetal y animal
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Ténicas histológicas

3.INCLUSIÓN en RESINA


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Para la observación de la ultraestructura celular es necesario hacer secciones de tejido muy delgadas, del orden de nanometros, denominadas ultrafinas, y usar un microscopio electrónico de transmisión. La obtención de secciones ultrafinas implica que tenemos que endurecer enormemente el tejido. Esto se puede conseguir mediante congelación, obteniendo entonces la secciones con un ultracriotomo. Sin embargo, lo más frecuente es incluir el tejido en un material de alta dureza como son las resinas de tipo epoxy, o en menor medida las resinas acrílicas como el metacrilato. Ambas se infiltran en el tejido en forma líquida y posteriormente polimerizan sin afectar a la ultraestructura celular.

El procedimiento estándar de inclusión en resinas tipo epoxy es similar al descrito para la parafina con algunas modificaciones. Así, los pasos que se siguen son fijación de las muestras por inmersión o perfusión, deshidratación, líquido intermediario, infiltración y polimerización en el medio de inclusión. Algunos medios de inclusión de tipo acrílico, por ejemplo la resina LR white, son parcialmente miscibles con el agua por lo que no son necesarios deshidratar completamente la muestra ni el líquido intermediario, y además polimerizan con luz ultravioleta a bajas temperaturas. Estos medios son buenos para estudios citoquímicos.

En las inclusiones en resinas tipo epoxy, normalmente para muestras que se observarán en el microscopio electrónico, se suelen seguir las siguientes recomendaciones:

a) Las soluciones fijadoras suelen contener glutaraldehído y es necesaria una postfijación posterior en tetróxido de osmio. Con ello nos aseguramos una fuerte fijación para preservar la ultraestructura celular y que no perderemos los lípidos que forman las membranas celulares durante el proceso de inclusión, gracias al tetróxido de osmio.

b) Partimos de tamaños de muestras mucho más pequeñas, de unos pocos milímetros, puesto que no nos interesa ver la organización general del tejido sino detalles del mismo. Si queremos observar zonas diferentes de un órgano es conveniente hacer bloques de muestra pequeños e independientes de cada una de ellas.

c) La resinas más comúnmente usadas para la inclusión no son hidrosolubles, por lo que tenemos que sustituir el agua del tejido por un solvente orgánico que sea miscible con la resina. Para ello se deshidrata el tejido mediante incubaciones sucesivas en gradaciones crecientes de etanol o acetona. Como líquido intermediario entre la acetona pura o el etanol de 100° y las resinas se suele utilizar el óxido de propileno.

d) El endurecimiento del medio de inclusión, la resina, no es por enfriamiento sino por polimerización, normalmente a 60 °C.

e) Al medio de inclusión, la resina, se le añaden aceleradores y plastificantes que regulan las características de la polimerización y la dureza de la resina polimerizada. Las resinas tipo epoxy son las más usadas puesto que aportan una mayor homogeneidad en las polimerización y más facilidad a la hora de obtener secciones regulares. Por el contrario las resinas acrílicas presentan algunos inconvenientes y hay que ser muy cuidadosos a la hora de elegir las condiciones de polimerización, obtención y tratamiento de los cortes ultrafinos.

A continuación se muestra un proceso de inclusión habitual en resinas de tipo epoxy.

Inclusión en resina

Esquema de la inclusión en resina de tipo epoxy de una muestra de tejido previamente fijada. Los tiempos de incubación en cada sustancia pueden variar en función del tamaño de la muestra o tipo de tejido.

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Actualizado: 12-12-2016. 09:39