Atlas de histología vegetal y animal
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Ténicas histológicas

2. MÉTODOS de FIJACIÓN

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Existen diferentes formas de fijar los tejidos dependiendo del tipo de fijador, de la estructura a fijar y de lo queramos observar. Los métodos de fijación se pueden clasificar en dos tipos: físicos y químicos.

Físicos

Los fijadores físicos se basan bien en una congelación muy rápida del tejido o bien en la aplicación de calor elevado. Se utilizan cuando los fijadores químicos alteran la estructuras que queremos observar, cuando necesitamos una fijación muy rápida, o cuando el tipo de tejido y la técnica que usaremos lo requieran.

La congelación rápida es un buen método de preservación de las características moleculares, puesto que no se verán alteradas por ninguna sustancia química. La congelación es conveniente que sea rápida puesto que así se impide la formación de grandes cristales de hielo que nos destrozarían la estructura del tejido. Por ello es conveniente no usar piezas mayores a 2 mm para que no se retarde la congelación de las zonas centrales de la pieza. Asimismo, cuando sea posible, es conveniente embeber la muestra en anticongelantes, también llamados crioprotectores. Una una congelación rápida se consigue sumergiendo la pieza en isopentano (-170 ºC) enfriado con nitrógeno líquido, o colocando la muestra sobre un metal, el cual se sumerge parcialmente en nitrógeno líquido (-196 ºC), en mezclas de hielo seco y acetona (-70 ºC) o incluso en helio líquido (-268 ºC). La crioprotección es siempre recomendable, aunque no siempre es posible. Normalmente se emplean como agentes crioprotectores al dimetilsulfóxido, el glicerol y la sacarosa, bien solos o mezclados en diferentes concentraciones. Hay que tener en cuenta, sin embargo, que una vez que el tejido se haya cortado se vuelve a descongelar y hay que protegerlo de los procesos de degradación. Existen variantes a la técnica de congelación como son la criodesecación o liofilización y la criosustitución. La criodesecación parte de tejido previamente congelado al que posteriormente se le sublima el hielo, es decir, el agua pasa de estado sólido a gaseoso sin pasar por estado líquido. Al eliminar el agua se impide que se den reacciones químicas, por lo que, además de la fijación, este método preserva el tejido en el tiempo. La criosustitución también parte de tejido congelado pero en este caso se produce una sustitución lenta del hielo por una solución fijadora. Con ello se posibilita una fijación química sobre un material que no ha sufrido deterioro puesto que está congelado.

La fijación por calor no es frecuente en histología, puesto que produce deterioros de los tejidos. Su efecto es la coagulación de proteínas y disolución de lípidos. Sin embargo, se emplea para la observación de microorganismos, ya que preserva la forma de éstos y sirve para su identificación. Hoy en día, sin embargo, se suele emplear el calor como un complemento a la fijación química. Así, las muestras inmersas en un fijador se introducen en un microondas y se llevan hasta temperaturas de unos 55 ºC. Esta temperatura no produce artefactos y tiene dos ventajas: incrementa la velocidad de fijación y reduce el tiempo fijación desde varias horas o días a decenas de minutos. El uso del microondas permite que el calor sea homogéneo en toda la muestra de forma inmediata (si se hiciera en un baño caliente habría un gradiente de calor en la muestra desde la parte externa a la más interna.). Se cree que el incremento de la velocidad de fijación se debe sólo al calor generado y no al efecto directo de las microondas. Las microondas se pueden usar también para otros pasos del proceso histológico como la tinción.

Químicos

Los métodos químicos utilizan soluciones acuosas compuestas por moléculas fijadoras que establecen puentes entre las moléculas del tejido, manteniéndolas en sus lugares originales e impidiendo su degradación. Hay que considerar que los fijadores químicos afectan al tejidos tanto física como químicamente. Los efectos físicos suelen ser retracciones o distensiones, y la mayoría endurecen el tejido. Hay dos métodos básicos de fijación con fijadores líquidos: inmersión y perfusión. En cualquier caso el fijador debe llegar a todas las partes el tejido lo más rápidamente posible.

Inmersión. En el método de inmersión las piezas de tejido se sumergen en la solución fijadora. En algunos casos se necesitan fijar extensiones de sangre o cortes por congelación sin fijación previa. En estos casos siempre se fijan por inmersión en la sustancia fijadora. Hay que tener en cuenta algunas precauciones.

1) Las piezas de tejido no deberían superar los 0.5 cm de espesor para que el fijador alcance el interior de la pieza antes de que ésta comience a deteriorarse. La velocidad de penetración del fijador depende de cada fijador y de las características del tejido. Esta velocidad nos condicionará el tamaño de la muestra. Para fijadores lentos se recomiendan piezas de 0.2 cm de tamaño. Esto también se ve afectado por el tipo de tejido. Por ejemplo, si es poroso o con grandes espacios la difusión del fijador será más rápida.

Inmersión

Fijación por inmersión.

2) El volumen recomendado de fijador es de 10 a 20 veces superior al volumen de la pieza.

3) La osmolaridad del tejido y de la solución fijadora deben estar equilibradas.

4) El pH del fijador debe ser próximo al fisiológico.

5) El tiempo de fijación, para una mismo tipo de muestra, depende de cada tipo de fijador: velocidad de difusión y velocidad de fijación (la rapidez e intensidad con la que establece puentes o coagula proteínas). Debe ser suficiente para que la muestra quede bien fijada pero no excesivo para evitar deterioros o alteraciones del tejido. Una agitación suave durante la fijación ayuda a la penetración del fijador y disminuye el tiempo. En general no se recomiendan fijaciones mayores de 24 horas, excepto en algunos casos como el formaldehído, para el que se puede emplear una semana de fijación.

Perfusión

Fijación por perfusión de un órgano. Mediante perfusión se consigue que la solución fijadora llegue a todas las células del órgano a través del sistema sanguíneo. Mediante una bomba peristáltica se introduce la solución fijadora a través de la arteria que irriga el órgano. Se obturan todos aquellos vasos arteriales que no conducen al órgano.

Perfusión. Por este procedimiento la solución fijadora se introduce a través del sistema circulatorio por el cual accede a todas las células del tejido gracias a la red de capilares. Mediante este método se puede fijar un animal completo introduciendo la solución fijadora a través del ventrículo izquierdo del corazón. El fijador llegará a todas las células irrigadas por la sangre bombeada por dicho ventrículo (circuito corporal). Si se quieren fijar los pulmones habría que introducir el fijador por el ventrículo derecho. También podemos fijar un único órgano en el caso de que podamos introducir la solución fijadora en la arteria principal que irriga dicho órgano. La perfusión no siempre es posible en algunos casos como en muchas biopsias o en los tejidos vegetales.

El método de fijación por perfusión es mucho más efectivo que el de inmersión ya que la solución fijadora llega rápidamente a escasa distancia de todas las células de la estructura perfundida. Por tanto, la velocidad de penetración del fijador no es una condición limitante.

Antes de introducir el fijador en el sistema de vasos sanguíneos hay que eliminar previamente la sangre con una solución de lavado oxigenada, de otra manera su interacción con el fijador produce trombos que impedirían la fijación de determinadas zonas del animal o del órgano. Respecto a las precauciones mencionadas anteriormente en el método de inmersión debemos cuidar aquí también la osmolaridad, el pH y el tiempo de fijación.

Perfusión

Fijación por perfusión de un organismo completo. Mediante este tipo de perfusión se introduce la solución fijadora en el sistema sanguíneo. La bomba peristáltica aporta la presión suficiente para permitir al fijador entrar a través del ventrículo izquierdo (Vi) y pasar a la aorta, desde la cual se distribuye por todo el cuerpo (excepto por el circuito pulmonar). Tras pasar por la red capilar la solución fijadora pasa a los vasos venosos que terminan por verter su contenido en la aurícula derecha (Ad). A esta cavidad hay que hacerle una abertura para que la solución fijadora, una vez realizada su función, salga del circuito. Ai: aurícula izquierda; Vd: ventrículo derecho.

Este método de fijación por perfusión requiere conocer la presión a la que se va a introducir la solución fijadora en el animal o estructura, la cual debe ser similar a la que posee la presión sanguínea normal en estado vivo. La presión que ejercerá la solución fijadora se puede regular mediante bombas peristálticas (ver figura) o por gravedad, es decir, variando la altura a la cual se coloca la solución fijadora respecto a la del animal. Esto es importante porque una presión muy baja podría impedir que la solución fijadora alcanzara todas las partes de la estructura y un presión muy alta podría provocar roturas de los vasos sanguíneos y de la propia estructura tisular.


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Actualizado: 14-09-2016. 10:45