Atlas de histología vegetal y animal

Ténicas histológicas

5.LECTINAS


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Aparte de las técnicas de tinción generales y las histoquímicas, no muy específicas, existen otras que se usan para detectar moléculas tisulares con una mayor especificidad. Ello es posible gracias a la capacidad que tienen ciertas moléculas como las lectinas o las inmunoglobulinas para reconocer y unirse sólo a un tipo de molécula presente en el tejido. En esta página vamos a tratar sobre el uso de las lectinas para la detección en los tejidos de distintos tipos de glúcidos de manera específica. En muchos textos la técnica de las lectinas se incluye dentro del apartado de la histoquímica.

Las lectinas son proteínas que tienen dominios o secuencias de aminoácidos que son capaces de reconocer y unirse a glúcidos terminales que forman parte de cadenas de oligosacáridos, bien libres o formando parte de otras moléculas como las glicoproteínas. Por ello se dice que las lectinas reconocen glicoconjugados. Las lectinas están ampliamente distribuidas en los tejidos animales y vegetales y sus funciones son muy variadas. Por ejemplo, la salida de los linfocitos desde el torrente sanguíneo hacia los tejidos dañados se produce gracias a la acción de una familia de lectinas denominadas selectinas que expresan las células endoteliales próximas al lugar de la lesión. Es decir, el linfocito puede salir por la pared endotelial gracias a la unión de las selectinas endoteliales a los glúcidos de la membrana del linfocito. En el laboratorio de histología las lectinas se usan, sin embargo, para estudiar la distribución tisular de distintos tipos de azúcares de manera específica. Se pueden usar diferentes tipos de lectinas en base a su especificidad de reconocimiento de azúcares determinados. Hay al menos cinco grupos de lectinas según se unan a manosa (Man), a galactosa/n-acetilgalactosamina (Gal/GalNAc), a N- acetilglucosamina (GllNAc), a fucosa (Fuc) o a ácido siálico (Neu5Ac), respectivamente.

Comercialmente hay disponibles docenas de lectinas diferentes que se nombran según el organismo animal o la planta de la que se obtienen. En el siguiente cuadro se listan las lectinas usadas comúnmente según el glúcido que reconocen.

Carbohidrato Nombre científico Acrónimo Carbohidrato específico
Glucosa / Manosa Galanthus nivalis

Canavalia ensiformis
Lens culinaris
Pisum sativum
GNA

Con-A
LCA
PEA
Manα1,3Man > Manα1,6Man > Manα1.2Man
αMan > αGlc > GlcNAc
αMan > αGlc > GlcNAc
αMan > αGlc > GlcNAc
N-Acetilglucosamina Griffonia simplicifolia

Datura stramonium
Tritricum vulgare
GSA-II

DSA
WGA
Terminal α,βGlcNAc, glucógeno
Galβ1,4GlcNAc(N-acetillactosamina) > GlcNAc
GlcNAc(β1,4GlcNAc)1-2 > β1,4GlcNAc1NeuAc
N-Acetilgalactosamina / galactosa Dolichus biflorus
Helix pomatia
Arachis hypogaea
Ricinus communis
DBA
HPA
PNA
RCA-I
GalNAcα1,3GalNAc > αGalNAc
GalNAcα1,3GalNAc > αGalNAc
Terminal Galβbe1,3GalNAc
Terminal βGal > αGal > GalNAc
L-Fucosa Aleuria aurantia
Lotus tetragonolobus

Ulex europaeus
AAA
LTA

UEA-I
αL-Fuc
αL-Fuc > αL-Fuc1,2Galβ1,4GlcNAc > L-Fucα1,2Galβ1,3GlcNAc
αL-Fuc
Ácido siálico Maackia amurensis
Sambucus nigra
MAA
SNA
NeuAcα2,3Galβ1,4GlcNAc
NeuAcα2,6Gal = NeuAcβ2,6GalNAc


Tabla con las lectinas más usadas en la que se muestra el carbohidrato o carbohidratos que se detectan, las especies de donde se obtienen las lectinas que reconocen a dichos carbohidratos, los acrónimos de las lectinas y los tipos de enlaces que se reconocen específicamente por cada lectina. El símbolo > significa afinidad creciente hacia su izquierda, lo que indica que una lectina puede reconocer a un carbohidrato específico enlazado de diferentes formas con otras moléculas, pero con diferente afinidad.

Para poder observar el lugar de unión específica entre la lectina y su glúcido tenemos que unir a la lectina un marcador que nos produzca una señal visible con el microscopio óptico o electrónico de transmisión. Normalmente el marcaje consiste en la unión de una enzima como la peroxidasa de rábano o la fosfatasa alcalina. Es el resultado de la reacción enzimática lo que se puede observar. También se usa como marcador una molécula fluorescente que se puede observar directamente en el tejido con un microscopio de fluorescencia. Cuando la enzima o la molécula fluorescente están directamente unidas a la lectina se denomina método de detección directa y cuando se unen a la lectina mediante una molécula interpuesta se denomina detección indirecta. Las moléculas interpuestas más comunes son la biotina o anticuerpos específicos (inmunoglobulinas tipo G) obtenidos contra la lectina.

Detección de glúcidos con lectinas

Detección de lectinas mediante métodos indirectos en cortes adyacentes de epitelio del pie de Haliotis tuberculata (oreja de mar, invertebrado prosobranquio). La imagen de la izquierda muestra la detección de glucosamina mediante la lectina WGA biotinilada y su posterior revelado de la peroxidasa unida a avidina (color marrón). En la imagen de la derecha se muestra la detección de fucosa mediante la lectina AAA unida a digoxigenina. Mediante un anticuerpo contra la digoxigenina unido a fosfatasa alcalina se pone de manifiesto la localización de la fucosa (color azul).

Proceso de detección con lectinas

Pasos para la detección de glúcidos con lectinas. Los tiempos pueden variar según el material o la lectina usada. En este ejemplo se usa un método de detección indirecta puesto que la lectina lleva unida una proteína intermediaria que es la biotina, la cual será reconocida por la avidina del complejo ABC ("avidin-biotin-complex") que contiene la enzima peroxidasa. Es el resultado de la reacción de este enzima tras añadir el substrato peróxido de hidrógeno y la molécula diaminobencidina, lo que produce un precipitado insoluble y visible con el microscopio óptico. El paso de BSA (albúmina de suero bovino) sirve para saturar posibles sitios de unión inespecíficos de la lectina. Si en vez de cortes en parafina hubiésemos usado cortes de vibratomo podríamos procesar, tras la reacción de la peroxidasa, dichos cortes para observar el producto de reacción con el microscopio óptico y también con el electrónico de transmisión.

La técnica con lectinas se suele complementar con una serie de tratamientos que sirven para obtener más información acerca de la composición sacarídica de los glicoconjugados. Por ejemplo, la desulfatación se usa para demostrar las uniones tipo ésteres de sulfato de las cadenas terminales y la eliminación tipo beta permite conocer si las cadenas de glúcidos son uniones con enlaces tipo O (uniones covalentes a grupos hidroxilo) o tipo N (enlaces covalentes a grupos amino). En este último caso la alcalinización de los cortes elimina las uniones tipo O.


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Actualizado: 15-05-2017. 09:39