Atlas de histología vegetal y animal
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Ténicas histológicas

4.CRIOTOMOS

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Microtomo de congelación

Microtomo de congelación. El tubo negro de la derecha es el encargado de enfriar el portabloques a temperaturas inferiores a -20 °C, lo cual congela a su vez a la muestra (color rojo). Las secciones se recogen de la cuchilla con un pincel y se colocan en tampón de trabajo.

La congelación de los tejidos es una manera rápida de endurecerlos sin necesidad de inclusión. Esto tiene una serie de ventajas. a) La preservación molecular es máxima, lo cual es muy importante si el procesamiento posterior requiere el reconocimiento molecular. b) Las muestras congeladas pueden cortarse en secciones finas, del orden de 5-15 µm, y más gruesas del orden de cientos de µm. El vibratomo permite también cortes sin incluir pero no se pueden conseguir secciones finas. c) La obtención de buenas secciones no depende del tipo de tejido (excepto tejidos mineralizados como el hueso o aquellos excesivamente cornificados). d) Por último, es posiblemente la manera más rápida de obtener secciones puesto que es posible congelar la muestra sin necesidad de fijación y cortarla de inmediato, como las biopsias. Pero para preservar correctamente la estructura del tejido ha de ser una congelación muy rápida, normalmente en isopentano enfriado con nitrógeno líquido, lo que evita la formación de cristales de hielo que deterioran las estructuras celulares.

Criostato

Criostato. El compartimento de color azul es la cámara refrigerada a la temperatura seleccionada. En esta cámara se encuentra la muestra, la cuchilla y es donde se recogen las secciones.

En el caso de que no se requiera un corte rápido las muestras normalmente se fijan y posteriormente se incuban en una solución anticogelante que contiene sacarosa y glicerol. Con ello se evita que durante la congelación se formen cristales de hielo grandes que puedan dañar las estructuras celulares. También se evitan daños tisulares con una congelación muy rápida, por ejemplo, con nitrógeno líquido. Dicha congelación permite preservar incluso la ultraestructura celular y observarla al microscopio electrónico, siempre con el uso previo de anticongelantes. Para observaciones que no necesiten una preservación ultraestructural se suele realizar la congelación de la muestra a temperaturas superiores (entre -80 oC y -20 oC) que dependen del aparato empleado para realizar los cortes, lo cual hace necesario el uso previo de anticongelantes.

Criostato

Criostato. El mecanismo de rotación y corte del criostato se encuentra dentro de una cámara refrigerada.

Los dos aparatos más usados para realizar cortes por congelación son el microtomo de congelación y el criostato. El microtomo de congelación realiza cortes de decenas de µm de grosor y consiste en una plataforma que se enfría a bajas temperaturas sobre la que se coloca la muestra. Tras cada corte la plataforma se eleva un espacio correspondiente al grosor de corte seleccionado. En los microtomos de congelación antiguos se producía la congelación mediante gas carbónico que había que suministrar regularmente. Actualmente se produce la congelación (de -30°C a -40 °C) de la plataforma mediante tubos que parten de un sistema de refrigeración externo al propio dispositivo de corte. Además, existe la posibilidad de congelar también la cuchilla si se desea. En los aparatos actuales la muestra se congela por contacto directo con la plataforma y su temperatura es constante durante todo el tiempo de corte. Las secciones que se obtienen, de decenas a cientos de µm, se recogen con un pincel, se añaden a un recipiente con tampón de trabajo y se trabaja con ellas en flotación, igual que en el caso del vibratomo.

Criostato

Criostato. Proceso mediante el que se pegan las secciones a un portaobjetos.

El criostato se utiliza para obtener secciones por congelación de 10 a 30 µm de grosor, aproximadamente. En este aparato todo el sistema de corte se encuentra encerrado en una cámara refrigerada cuya temperatura se puede regular, normalmente entre -20 y -30 °C. La congelación se suele hacer en una plataforma dentro de la propia cámara refrigerada que se encuentra a una temperatura inferior, en torno a -50 °C. También se puede congelar el tejido externamente con la rapidez que deseemos, por ejemplo con nitrógeno líquido, pero es conveniente colocar la muestra en la cámara del criostato hasta que consiga igualar su temperatura con la de ésta para obtener secciones homogéneas. Antes de la congelación, la muestra se encastra en un medio que es líquido a temperatura ambiente y sólido a la de corte. Por tanto, tenemos nuestra muestra en un bloque sólido, encastrada pero no incluida. Esto permite manipular la muestra y adherirla a un soporte portamuestras, el cual se fijará a un eje que avanza sobre la cuchilla. La preparación del bloque y el mecanismo de corte es similar al que se describió para el microtomo de rotación para parafina. Las secciones que se van obteniendo se adhieren por contacto a portaobjetos con superficies adhesivas. Las secciones se descongelan rápidamente en este proceso de pegado puesto que los portaobjetos están a temperatura ambiente y una vez secas pueden procesarse para las técnicas que deseemos.

Todavía existe un tipo de criotomo mucho más sofisticado denominado ultracriotomo. Este aparato se emplea para obtener secciones ultrafinas, del orden de decenas de nanometros, para su observación con el microscopio electrónico de transmisión. La ventaja de este aparato respecto al ultramicrotomo (ver en siguiente página) es que los tejidos no pasan por solventes orgánicos y no temperaturas elevadas y por tanto la preservación molecular es mayor.


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Actualizado: 20-02-2017. 13:45