Atlas de histología vegetal y animal

Técnicas histológicas. Protocolos.

DESCALCIFICACIÓN

Cuando hay minerales en los tejidos, como por ejemplo en el hueso, dentina, o en procesos patológicos calcificantes en tejidos blandos, es muy difícil obtener buenas secciones finas, bien sea de material incluido en parafina o de material en congelación. En estos casos el proceso histológico debe incluir un paso en el que se eliminan tales minerales denominado generalmente como descalcificación puesto que en la mayoría de los casos se eliminan minerales de calcio. Hay, sin embargo, maneras de obtener secciones de tejido mineralizado sin descalcificar. Por ejemplo mediante limado progresivo se pueden conseguir láminas muy finas de material a modo de secciones que se observan al microscopio óptico. Otro procedimiento es incluir los tejidos mineralizados en resinas plásticas y obtener secciones semifinas con cuchillas especiales de acero y microtomos muy fuertes.

El principal mineral duro de los tejidos animales es la hidroxiapatita [Ca10(PO4)6(OH)2], que se encuentra en los huesos distribuido entre las fibras de colágeno. Estos minerales se encuentran en equilibrio con su solución saturada según las siguiente reacción:

Ca10(PO4)6(OH)2 = 10Ca2+ + 6PO43- + 2OH-

Si eliminamos alguno de los componentes a la derecha de la reacción, el mineral (a la izquierda) se disolverá para equilibrar de nuevo la solución. Este es el principio de los descalcificantes. A la hora de elegir los tiempos y sustancias descalcificantes hay que tener en cuenta si estamos interesados en el hueso compacto o en el esponjoso. Por ejemplo, las sales minerales tardan más en disolverse en el hueso compacto.

La descalcificación se realiza normalmente después de la fijación, aunque a veces se hace tras la inclusión en parafina eliminando la sales de calcio sólo de las micras más superficiales del plano de corte de la muestra. Es importante realizar una buena fijación del tejido puesto que el tejido será incubado en soluciones ácidas relativamente agresivas. Además, es bueno eliminar bien los restos de fijador con lavados abundantes para evitar reacciones química con los agentes descalcificadores. Los tiempos de fijación del hueso que se va a descalcificar suelen ser mucho mayores que para otros tejidos. El mejor método de fijación es la perfusión, pero si no es posible es conveniente hacer piezas pequeñas con sierras de dientes muy finos y eliminar los tejidos que rodean al hueso antes de sumergirlo en fijador. Los mejores fijadores son Bouin, mezclas de formalina con zinc, o FAA (formol, acético, alcohol).

Hay dos grupos principales de agentes descalcificantes: los ácidos y los quelantes de calcio. A continuación veremos los descalficantes más comunes.

Basados en ácidos

Los ácidos aportan hidrógenos y eliminan iones hidroxilos del medio por lo que la reacción antes mendionada tiende hacia la solubilización del mineral.

H+ + 2OH- = H2O

Hay dos grupos de ácidos: los fuertes (inorgánicos) y los débiles (orgánicos). Los primeros suelen ser rápidos pero son ácidos muy agresivos por lo que el tiempo debe ser el justo, ya que si es excesivo producen daños en los núcleos y maceran el tejido, mientras que los segundos son más lentos pero preservan mejor al tejido. Los ácidos fuertes más usados son el ácido clorhídrico, el ácido nítrico, mientras que el débil es el ácido fórmico. Cuanto más agresivos son los ácidos más se deterioran las enzimas y los antígenos para realizar pruebas enzimáticas o inmunocitoquímicas. Los ácidos también deterioran los ARN citosólicos por lo que las hibridaciones in situ se ven comprometidas

El ácido clorhídrico y el ácido nítrico se suelen usar al 5-10 % en agua. Descalcifican rápidamente y su acción no debería prolongarse más de 24-48 horas. No son recomendables para inmunocitoquímica ni ensayos enzimáticos. Se emplean para muestras pequeñas y diagnósticos rápidos.

El ácido fórmico es el ácido débil más usado como descalcificante. Se puede usar en solución acuosa (5-10 %), tamponado (con ácido cítrico) o combinado con formalina. En este último caso la descalcificación va acompañada de fijación. El tiempo de tratamiento con ácidos débiles es más prolongada (1 a 10 días), dependiendo del tamaño y tipo de hueso, y de la concentración de ácido. La solución debería cambiarse cada 24 o 48 horas.

Otros ácidos débiles como en el acético o el ascórbico se usan cundo se va a proceder a realizar pruebas inmunocitoquímicas. La descalcificación se realiza en estos casos con pH por encima de 2.5.

Agentes quelantes

Los agentes quelantes son aquellas sustancias orgánicas que pueden unirse covalentemente a iones metálicos formándose un compuesto soluble llamado quelato de metal. El EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) secuestra iones de calcio, presentes en los cristales de hidroxiapatita del hueso, por lo que progresivamente irá disminuyendo el tamaño del cristal. Se usa entre el 10 y el 14 % en soluciones acuosas o tamponadas. Es un proceso lento, la descalcificación se puede extender durante semanas, pero aporta una buena preservación de la estructura tisular. Se puede acelerar el proceso aumentando el pH de la solución (superior a 7), pero esto puede afectar a la calidad del tejido. El EDTA une calcio superficial del cristal y por tanto lo que se produce es una reducción progresiva del tamaño de los cristales. Es un proceso muy lento (6 a 8 semanas) pero que no daña el tejido. Así, cuando el tiempo no es importante es el método recomendado. La solución deberia cambiarse cada 3 a 5 días.

En cualquiera de los dos métodos,ácidos o quelantes, hay variables que pueden disminuir el tiempo de descalcificación como el aumento de la temperatura o agitación suave del tejido. Hay otros más agresivos como sonicación o microondas pero hay que controlar los daños al tejido.

Averiguar el grado de descalcificación es importante para determinar el tiempo necesario que tienen que incubarse las muestras en las soluciones descalcificadoras. Ya se comentó que incremento de tiempo innecesario puede repercutir en la calidad del tejido, pero si es corto pueden quedar cristales en el tejido que dificulten el corte y procesamiento del hueso. El calcio del mineral termina en solución y si la solución descalcificante se cambia periódicamente se podrá averiguar cuándo se ha producido la descalcificación completa mediante la medición de la concentración de calcio en el medio. Cuando se emplean ácidos como descalcificantes se puede realizar una comprobación química: se añade oxalato de amonio a la solución descalcificante, que ha sido neutralizada con hidróxido amonio. Si hay calcio en la solución se forman precipitados de oxalato de calcio, lo que indica que aún quedan minerales en el hueso.

A veces, sin embargo, es necesario mantener el contenido mineral del hueso y la descalcificación no se lleva a cabo. En estos casos es posible obtener secciones mediante procedimientos no convencionales. Por ejemplo, se puede serrar el hueso en lonchas más a menos finas y luego limar las superficies hasta llegar a un grosor óptimo para su observación con el microscopio. También se puede infiltrar el hueso con resinas que al polimerizar alcanzan una dureza similar a la del hueso, y posteriormente cortar la muestra incluida con microtomos especiales como el ultramicrotomo cuando se usan cuchillas de diamante. Otra posibilidad es realizar cortes por congelación.