Atlas de histología vegetal y animal

Técnicas histológicas. Protocolos.

NADPH DIAFORASA

La actividad NADPH-diaforasa es el nombre genérico que se aplica para cualquier enzima con la capacidad de transferir electrones entre el NADPH o NADH y distintos aceptores, entre los que se encuentran las sales de tetrazolio. Las sales de tetrazolio reducidas forman moléculas insolubles y azuladas llamadas formazanos. Así, esta técnica pone de manifiesto cualquier deshidrogenasa que utilice NADPH como donador de hidrógenos y sales de tetrazolio como aceptor. Por ejemplo, se ha usado para poner de manifiesto la succinato deshidrogenasa.

En el sistema nervioso central esta técnica pone de manifiesto diversas poblaciones de neuronas que expresan la enzima óxido nítrico sintasa neuronal, la cual produce óxido nítrico, considerado como un neurotransmisor atípico. Pero también detecta la enzima óxido nítrico endotelial en los vasos sanguíneos del encéfalo. Por tanto estas enzimas poseen activada deshidrogenasa. La equivalencia entre la expresión de la enzima óxido nítrico sintasa y la actividad NADPH-diaforasa ha permitido estudiar estas poblaciones neuronales productoras de óxido nítrico de una manera sencilla y rápida. Aunque hay que tener precaución en la interpretación de los resultados, puesto que el resultado de la técnica depende en cierta medida del fijador y proceso de fijación de la muestra.

Procedimiento
  • Partimos de cortes de material fijado con paraformaldehído al 4 %. Los cortes se obtienen mediante vibratomo o por congelación.
  • 1.- 2x10 min en tampón fosfato 0.1 M pH 7.4 (TF).
  • 2.- 2x10 min en TF con Triton X-100 al 0.3 % con agitación.
  • 3.- 10 min en TF + 0.3 % de Triton X-100 + NADPH (0.5 mg/ml) + Nitro azul de tetrazolio (0.2 mg/ml).

    Incubación con agitación.
    A temperatura ambiente.
    Protegido de la luz.

  • 4.- 2-6 horas a 37 ºC en la solución anterior.
  • 5.- Parar el revelado con lavados en TF.
  • 6.- Deshidratar y montar.

    Si los cortes son de vibratomo en flotación han de pegarse tras el revelado sobre portas recubiertos con gelatina. Se pueden usar pinceles para la manipulación de los cortes.

  • Resultados

    Neuronas, prolongaciones nerviosas: azul.
    Vasos sanguíneos: azul.

    Consejos

    Si los cortes no se lavan bien tras la fijación los resultados pueden no ser adecuados.

    Si el proceso de revelado es muy largo puede aparecer precipitado de formazano. Se puede evitar sustituyendo la solución de revelado por otra fresca.

Productos
  • Xileno
  • Etanol de 50º, 70º, 80º, 90º, 96º y 100º
  • Nitro azul de tetrazolio
  • NADPH
  • Tampón fosfato 0.1 M pH 7.4
  • Triton X-100
  • H2O destilada
  • Medio de montaje
Material
  • Cubetas de tinción
  • Filtro de papel
  • Pincel
  • Papel de aluminio
  • Agitado orbital
  • Estufa a 37 ºC
  • Portas recubiertos de gelatina
  • Cubreobjetos
Corteza dorsal

Sección de cerebro de ratón procesada para la detección de la actividad NADPH diaforasa.