Atlas de histología vegetal y animal
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Técnicas histológicas. Protocolos.

IMPREGNACIÓN de GOLGI en CORTE

La observación de las neuronas tiene la complicación de que es muy difícil poner de manifiesto sus árboles dendríticos y axónicos. Mediante la técnica de Golgi, que es un impregnación de plata, se pueden observar neuronas individuales, tanto el soma como sus dendritas y axones. Esta técnica tiene la peculiaridad de que sólo revela un pequeño porcentaje de las neuronas, con lo cual se pueden estudiar de manera prácticamente individualizada. También se ponen de manifiesto a los astrocitos. La base química de esta reacción es desconocida, así como el porqué unas neuronas se impregnan y otras no. Esta técnica permitió observar por primera vez la morfología de las neuronas.

La impregnación de Golgi se aplica a bloques de tejido nervioso relativamente gruesos (0.5 a 1 cm aproximadamente). A continuación describimos una adaptación de esta técnica a cortes gruesos de unas 100 µm de grosor.

Procedimiento
  • Partimos de cerebros o médula espinal que han sido fijadas preferentemente con paraformaldehído tamponado al 4%. El tejido se corta en un vibratomo en secciones de 100 a 300 µm de grosor. Los cortes se usan en flotación y pueden quedar en nevera durante días antes de su uso.
  • 1.- 10 min tetróxido de osmio al 1 % en tampón fosfato (PB 0.1 M pH 7.3)

    El tetróxido de osmio es muy tóxico y volátil, luego su manejo ha de hacerse en campana extractora y con guantes. Una vez usado es necesaria su inactivación con aceite de maíz.

  • 2.- 2x10 min en PB.
  • 3.- 2-3 horas en dicromato potásico al 3.5 % en agua destilada.
  • 4.- Montado de los cortes en un portaobjetos.
  • 5.- Eliminación del exceso de dicromato potásico con un papel del filtro.
  • 6.- Colocación de un cubreobjetos sobre la sección procurando que no queden burbujas.
  • 7.- Añadir entre el portaobjetos y el cubreobjetos, por capilaridad, nitrato de plata al 1.5 %.

    Con una micropipeta se añaden lentamente gotas de la solución de manera que se extiendan por capilaridad.

  • 8.- Colocar en cámara húmeda y en oscuridad hasta la aparición de las neuronas impregnadas.

    El tiempo de impregnación es variable y puede durar varias horas hasta uno o dos días. De cualquier manera se puede controlar con el microscopio el desarrollo de la reacción y su detención cuando se estime oportuno.

  • 9.- Deshidratación muy rápida.

    Para que la impregnación se mantenga intensa y duradera es preciso hacer una deshidratación rápida e incluir en resinas empleadas en las técnicas de microscopía electrónica.

  • 10.- 2x5 min en óxido de propileno.
  • 11.- Resina tipo epoxy toda la noche a temperatura ambiente.
  • 12.- 48 h polimerización a 60 ºC
  • Resultados

    Neuronas: marrón oscuro a negro.
    Astrocitos: marrón oscuro a negro.
    Resto de tejido. marrón muy claro, anaranjado.
    Vasos sanguíneos: a veces se marca el endotelio de color oscuro.

    Consejos

    El tiempo en tetróxido de osmio parece afectar a la cantidad y rapidez de neuronas marcadas pero es variable para cada muestra.

    Es importante que la solución de nitrato de plata sea transparente, nada de turbidez, lo que indica que la solución está en buen estado.

    La permanencia prolongada en los alcoholes durante la deshidratación (más de dos o tres minutos) en los alcoholes atenúa el marcaje

    El montaje con medios de montaje convencionales usados tras el xileno no permite la perdurabilidad de la impregnación y termina por desvanecerse.

Productos
  • Etanol de 50º, 70º, 80º, 90º, 96º y 100º
  • Tetróxido de osmio
  • Dicromato potásico
  • Nitrato de plata
  • Resina tipo epoxy
  • H2O destilada
Material
  • Cámara húmeda
  • Cubreobjetos
  • Papel de filtro
  • Pinceles
  • Estufa a 60 º
  • Aceite de maíz
Hematoxilina-eosinaHematoxilina-eosina

Neuronas (imagen de arriba) y glía (imagen de abajo) impregnadas por el método de Golgi en corte
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