Atlas de histología vegetal y animal


Técnicas histológicas. Protocolos.

TINCIÓN: AZÁN de HEIDENHAIN



Este método es una modificación de la tinción tricrómica de Mallory. Su ventaja es que diferencia una mayor diversidad de estructuras histológicas, sobre todo por la obtención de imágenes nucleares con diferente coloración. El protocolo debe adaptarse a cada tipo de material, siendo necesarios ensayos previos.

Procedimiento
  • Partimos de muestras que han sido fijadas e incluidas en parafina. Estas muestras se han cortado en secciones de unas 8 µm y adheridas a portaobjetos recubiertos con gelatina. Cuando los cortes provienen de material que ha sido fijado con un fijador que contiene ácido pícrico hay que eliminarlo mediante permanencia en alcohol con anilina (1% de anilina en etanol de 96º) durante 30 minutos.
  • 1.- Xileno para desparafinar, 2x10 min.
  • 2.- Etanol 100º, 2x10 min.
  • 3.- Etanol 96º, 10 min.
  • 4.- Etanol 80º, 10 min.
  • 5.- Etanol 50º, 10 min.
  • 6.- H2O destilada, 5 min.
  • 7.- Azocarmin previamente calentado a 60 ºC durante, 1 h a 60ºC

    Azocarmin G:
    0.1 g de azocarmín G (C.I. 50085)
    200 ml H2O destilada
    2 ml de ácido acético

  • 8.- H2O destilada, varios lavados.
  • 9.- Diferenciar bajo el microscopio mediante inmersiones sucesivas en alcohol-anilina (anilina al 0.1 % en etanol 96º).

    La velocidad de diferenciación es proporcional a la cantidad de anilina y a la concentración del alcohol. Según el resultado deseado, puede modificarse la composición de la mezcla alcohol-anilina, desde alcohol de 70º con un 1% de anilina, hasta el alcohol de 96º con un 0,1% de anilina.

  • 10.- Detener la diferenciación con etanol-acético (ácido acético 1% en etanol 96º)
  • 11.- H2O destilada, varios lavados.
  • 12.- Ácido fosfotúngstico al 5%, 1 hora.

    Este ácido actuará como mordiente y prepara la tinción con el azul de Heidenhain al mismo tiempo que continúa la diferenciando el azocarmin.

  • 13.- H2O destilada, varios lavados.
  • 14.- Azul de Heidenhain, 2 h.

    Azul de Heidenhain:
    0.2 g de azul de anilina (C.I. 42755)
    0.5 g de naranja G (C.I. 16230)
    100 ml de H2O destilada
    1 ml de ácido acético

  • 15.- Etanol 96º, una inmersión rápida.
  • 16.- Etanol 100º, varias inmersiones rápidas.
  • 17.- Xileno, 2x10 min.
  • Resultados

    Núcleos: distinta coloración, desde naranja a rojo
    Citoplasma: coloración diversa
    Músculo: naranja a rojo
    Colágeno: azul

    Consejos

    Hay que modificar el protocolo según la muestra con el que se esté trabajando.

    Son críticos los pasos de diferenciación.

    La deshidratación final ha de ser muy rápida para no perder la coloración azul.

Productos
  • Xileno
  • Etanol de 50º, 80º, 90º, 96º y 100º
  • Azocarmín G (C.I. 50085)
  • Anilina
  • Azul de anilina (C.I. 42755)
  • Naranja G (C.I. 16230)
  • Ácido fosfotúngstico
  • Ácido acético
  • H2O destilada
  • Agua corriente
  • Medio de montaje
Material
  • Cubetas de tinción
  • Estufa a 60 ºC
  • Cesta para portas
  • Cubreobjetos
Hematoxilina eosina azul alcián Hematoxilina eosina azul alcián

Secciones de piel (arriba) y pulmón (abajo) teñidas con azán de Heidenhain. En la imagen de pulmón se puede observar como hay núcleos teñidos con diferente coloración, desde rojo oscuro a gris pálido, pasando por el naranja.