Atlas de histología vegetal y animal
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Técnicas histológicas. Protocolos.

TINCIÓN: SAFRANINA
AZUL ALCIÁN / VERDE RÁPIDO

Así como para observar tejidos animales es imprescindible usar colorantes que diferencien el núcleo del citoplasma, en el caso de los tejidos y órganos vegetales se usan colorantes con afinidad por las paredes celulares. La tinción vegetal por excelencia se caracteriza por usar la safranina, que presenta afinidad por las paredes lignificadas (paredes secundarias), y un segundo colorante que puede ser el azul alcián o en ocasiones el verde rápido, ambos con afinidad por las paredes celulósicas (paredes primarias).

Procedimiento
  • Partimos de muestras fijadas con FAA (formaldehído, alcohol, acético) y cortadas en vibratomo o microtomo de congelación. Los cortes tendrán un grosor mínimo de 40-50 μm y se manipulan con pincel, en placas de porcelana provista de cavidades. También se puede hacer a partir de cortes de parafina, pero hay que modificar los tiempos.
  • Safranina / azul alcián
  • 1.- Lavar los cortes en etanol de 70o y pasar por etanol de 50o.
  • 2.- 1 min de tinción en safranina.

    Safranina (C. I. 75100): 1 g
    Etanol 95o: 15.5ml
    Agua destilada: 14.5 ml
    Antes de usar, mezclar la solución madre y etanol 50o (1:1)

  • 3.- 4 x 20 s lavados en agua destilada.
  • 5.- 3 min de tinción en azul alcián (1 %, pH 2.5).

    Azul alcián: 1 g
    Agua: 97 ml
    Ácido acético glacial 3 ml
    Poner en agitación magnética al menos una hora posteriormente filtrar. Se puede usar duración: varios años

  • 6.- 1 min en agua destilada.
  • 7.- Diferenciar con alcohol de 96o hasta que la mayor parte del tejido adquiera color azul claro. Es conveniente controlar el proceso de diferenciación bajo lupa.
  • 8.- 1 min en etanol 100o.
  • 9.- 1 min en xileno.
  • 10.- Montado en medio de montaje.

  • Safranina / verde rápido
  • 1.- Lavar los cortes en etanol de 70o y pasar por etanol de 50o.
  • 2.- 5 min incubar en safranina.

    Safranina (C. I. 75100): 1 g
    Etanol 95o: 15.5ml
    Agua destilada: 14.5 ml
    Antes de usar, mezclar la solución madre y etanol 50o (1:1)

  • 3.- 4x20 s lavados en agua destilada.
  • 4.- 1 min sumergir las muestras en etanol 96o.
  • 5.- 60 s (o menos) de incubación en verde rápido (1%). Este colorante "compite" con la safranina y por tanto a más tiempo menos color rojo de la safranina quedará en la sección).

    Etanol 100o: 50 ml
    Esencia de clavo: 50 ml
    Verde rápido (C. I. 42053): 1 g.

  • 6.- 1 min en etanol 100o.
  • 7.- 1 min en xileno.
  • 8.- Montado en medio de montaje.
  • Resultados

    Paredes vegetales primarias: azul (con azul alcián) o verde (con verde rápido).
    Paredes vegetales secundarias: rojo. Paredes con suberina y cutina: rojo.

    Consejos

    Generalmente el protocolo para obtención de cortes histológicos vegetales incluye el uso de vibratomo o micrótomo de congelación. Este método es rápido y corto pero existe la posibilidad de incluir el tejido vegetal en bloques de parafina. En este caso el método de inclusión es más largo que para los tejidos animales debido a que la pared vegetal es una barrera para el paso de sustancias.

Productos
  • Xileno
  • Etanol de 50º, 70º, 90º y 100º
  • Ácido acético glacial
  • Safranina
  • Azul alcián (1%; pH 2.5)
  • Verde rápido (1%)
  • H2O destilada
  • Medio de montaje
Material
  • Placa de cerámica excavada
  • Pinceles
  • Portaobjetos
  • Cubreobjetos
  • Agitador magnético
Safranina azul alcián

Corte en vibratomo teñido con safranina / azul alcián.
Safranina azul alcián

Corte en vibratomo teñido con safranina / verde rápido. (Imagen cedida por Rafael Álvarez Nogal. Departamento de Biología molecular. Universidad de León)
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