Atlas de histología vegetal y animal
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Técnicas histológicas. Protocolos.

TINCIÓN: SAFRANINA

AZUL ALCIÁN o VERDE RÁPIDO

Así como para observar tejidos animales es imprescindible usar colorantes que diferencien el núcleo del citoplasma, en el caso de los tejidos y órganos vegetales se usan colorantes con afinidad por las paredes celulares. La tinción vegetal por excelencia se caracteriza por usar la safranina, que presenta afinidad por las paredes lignificadas (paredes secundarias), y un segundo colorante que puede ser el azul alcián o en ocasiones el verde rápido, ambos con afinidad por las paredes no lignificadas (paredes primarias).


Procedimiento
  • Partimos de muestras fijadas con FAA (formaldehído, alcohol, acético) y cortadas en vibratomo o en microtomo de congelación, o de cortes de inclusiones en parafina. Los cortes gruesos tendrán un grosor mínimo de 40-50 μm y se manipulan con pincel, haciendo los pasos en los diversos líquidos en pocillos pequeños de pequeño volumen. Los cortes de parafina se procesan de manera convencional. Hay que emplear tiempos diferentes según el tipo de corte.
  • Safranina / azul alcián
  • 1. Etanol de 50o. 5 min.
  • 2. Tinción en safranina. 1 min.

    Safranina (C. I. 75100): 1 g.
    Etanol 95o: 15.5 ml.
    H2O destilada: 14.5 ml.
    Antes de usar, mezclar esta solución (solución madre) y etanol 50o (1:1).

  • 3. H2O destilada. 4 x 20 s.
  • 5. Tinción en azul alcián (1 %, pH 2.5). 3-5 min.

    Azul alcián (C.I. 74240): 1 g.
    H2O: 97 ml.
    Ácido acético glacial 3 ml.
    Poner en agitación al menos una hora y posteriormente filtrar. Se puede usar durante varios años.

  • 6. H2O destilada. 1 min.
  • 7. Diferenciar con alcohol de 96o hasta que la mayor parte del tejido adquiera color azul claro. Es conveniente controlar el proceso de diferenciación bajo lupa.
  • 8. Etanol 100o. 1 min.
  • 9. Xileno. 1 min.
  • 10. Montado con cubreobjetos y medio de montaje.

  • Safranina / verde rápido
  • 1. Etanol de 50o. 5 min.
  • 2. Tinción en safranina (1 %, pH 2.5). 3 - 5 min.

    Safranina (C. I. 75100): 1 g
    Etanol 95o: 15.5ml
    H2O destilada: 14.5 ml
    Antes de usar, mezclar esta solución (solución madre) y etanol 50o (1:1).

  • 3. H2O destilada. 4 x 20 s.
  • 4. Etanol 96o. 1min.
  • 5. Tinción en verde rápido (1%). 60s.
    Este colorante "compite" con la safranina y por tanto a más tiempo menos color rojo de la safranina quedará en la sección.

    Etanol 100o: 50 ml.
    Esencia de clavo: 50 ml.
    Verde rápido (C. I. 42053): 1 g.

  • 6. Etanol 100o. 1min.
  • 7. Xileno. 1 min.
  • 8. Montado con cubreobjetos y medio de montaje.
  • Resultados

    Paredes vegetales primarias: azul (con azul alcián) o verde (con verde rápido).
    Paredes vegetales secundarias: rojo.
    Paredes con suberina y cutina: rojo.

    Consejos

    Generalmente el protocolo rápido para obtención de cortes histológicos vegetales supone el uso de vibratomo o micrótomo de congelación. Sin embargo, se pueden obtener buenas tinciones y calidad del tejido con inclusión en parafina y cortes por debajo de las 10 µm. El proceso es más largo que para los tejidos animales debido a que la pared vegetal es una barrera para el paso de sustancias.

Productos
  • Xileno
  • Etanol de 50º, 70º, 90º y 100º
  • Ácido acético glacial
  • Esencia de clavo
  • Safranina (C. I. 75100)
  • Azul alcián (C.I. 74240)
  • Verde rápido (C. I. 42053)
  • H2O destilada
  • Medio de montaje
Material
  • Placa de cerámica excavada
  • Pinceles
  • Portaobjetos
  • Cubreobjetos
  • Agitador magnético
Safranina azul alcián

Corte en parafina teñido con safranina / azul alcián.

Safranina azul alcián

Corte en vibratomo teñido con safranina / verde rápido. (Imagen cedida por Rafael Álvarez Nogal. Departamento de Biología molecular. Universidad de León).

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